慢性高原病患者骨髓有核紅細胞Bcl-2家族基因表達研究*

熊 華，馬 婕，崔 森

(青海大學附屬醫院血液科，青海西寧 810001)

慢性高原病(CMS)是一種長期在高海拔環境下機體穩態紊亂所致的慢性疾病狀態，并產生一系列生理功能改變。機體長期暴露于低氧環境，處于過度疲勞、睡眠不佳等狀態，造成機體各器官功能的減退，甚至發生高原衰退癥，其發病機制目前仍未完全明確。通過低氧暴露下機體生理變化的研究，明確了低氧與紅細胞過度增加的關系，過去的研究主要關于紅細胞增殖機制。近年來對CMS患者骨髓單個核細胞凋亡的研究，證明了細胞凋亡在CMS發病過程中的作用。骨髓有核紅細胞是人體內產生紅細胞的重要來源，本研究用流式細胞術、實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)等實驗方法檢測CMS患者骨髓有核紅細胞中Bcl-2家族部分分子的表達，從而了解CMS骨髓紅系前體細胞凋亡變化情況，探討Bcl-2家族蛋白在CMS患者紅細胞過度增生過程中的作用，為臨床積累科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2016年7月就診于本院的26例CMS患者為CMS組，均為漢族男性，平均(50.2±11.4)歲，長期居住在海拔2 500～4 500 m青藏高原，其診斷符合第六屆國際高原醫學和低氧生理學術大會(中國西寧，2004年)推薦的CMS診斷標準，平均血紅蛋白(Hb)為(221.90±18.04)g/L，CMS積分為(11.00±1.54)分，并排除急慢性感染、腫瘤、骨髓增殖性腫瘤、免疫相關性疾病、先天性心臟病及其他原因引起的繼發性紅細胞增多癥等。以在同一海拔高度地區居住時間接近，并同期在本院體檢的26例體檢健康者為對照組，均為漢族男性，平均(46.90±13.80)歲，平均Hb為(137.07±17.60)g/L，CMS積分為(2.00±0.72)分，排除心、肺、腎等器官疾病及慢性感染疾病。在性別、年齡、種族等方面兩組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。研究方案征得研究對象的同意并經本院倫理委員會審議通過。

1.2方法

1.2.1標本采集及處理 (1)選取髂后上棘為穿刺點，采集研究對象骨髓液約5 mL，收集至肝素抗凝管中，用Ficoll密度梯度分離液(美國Sigma公司)分離出骨髓單個核細胞(BMMNCs)，制成細胞懸液。(2)經研究對象肘前靜脈抽血4 mL，收集至促凝采血管中，靜置30 min，1 000 g 離心3 min，留取上清液。

1.2.2骨髓有核紅細胞凋亡檢測 在細胞懸液中加入CD71+抗體磁珠(德國美天旎公司)4 ℃放置15 min，然后400 g離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS。重懸沉淀后，400 g離心5 min，棄上清，沉淀重懸于500 μL PBS中。通過美天旎磁珠分選系統收集CD71+陽性細胞，計算CD71+細胞數。并將收集到的1×106個單個核細胞懸浮在100 μL PBS中，管中先后加入APC標記的CD71+單克隆抗體10 μL、Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL，避光孵育5 min，流式細胞術檢測，獲取40 000個細胞測定凋亡。

1.2.3qPCR檢測 提取總RNA，使用Nanodrop 2000測定總RNA濃度。然后進行cDNA第一鏈的合成。后根據天根SuperReal熒光定量試劑盒配制20 μL反應體系，按反應程序進行qPCR反應，反應結束后，統計數據。

2 結 果

2.1CMS組與對照組骨髓CD71+細胞凋亡率比較 CMS組骨髓CD71+細胞凋亡率為2.40%，對照組骨髓CD71+細胞凋亡率為2.30%，兩組比較，差異無統計學意義(t=0.409，P=0.686)。見圖1、2。

表1 CMS組和對照組Bax、Bcl-xl、Bcl-2 mRNA水平

2.2CMS組與對照組骨髓有核紅細胞凋亡相關mRNA比較 CMS組患者骨髓有核紅細胞Bax mRNA表達水平較對照組下降，差異有統計學意義(P<0.05)；CMS組骨髓有核紅細胞Bcl-2、Bcl-xl mRNA表達水平較對照組有下降趨勢，但兩組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3相關性分析 通過Pearson積差相關分析，兩組Hb 與凋亡率、Bax mRNA均無相關性(P>0.05)，見表2。

圖1 流式細胞儀檢測CMS組與對照組骨髓CD71+細胞凋亡

圖2 CMS組與對照組骨髓CD71+細胞凋亡率比較

表2 CMS組患者骨髓CD71+細胞凋亡率與凋亡相關mRNA水平相關性

3 討 論

根據本研究的結果，CMS組骨髓有核紅細胞Bax mRNA表達水平較對照組明顯下降，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，此結果與鄒成林等[1]、孫敏敏等[2]研究結果相同，提示促凋亡蛋白的下降在CMS發病機制中具有一定作用。但與其他學者不一致的研究結果是CMS組骨髓有核紅細胞Bcl-2 mRNA表達水平與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。研究發現[3]，大鼠在缺血缺氧狀態下，隨著缺氧時間延長，其腦部Bcl-2 mRNA的表達水平與缺氧時間呈正相關關系，但極度的缺血缺氧會導致Bcl-2 蛋白的表達水平明顯下降。由此可知，在某些特定條件下，Bcl-2 家族的蛋白水平并不與mRNA的表達水平一致，其原因可能與Bcl-2轉錄調控的多樣性及轉錄后調控有關。現已有研究證實在正常的淋巴系統中，小淋巴細胞一級淋巴濾泡中Bcl-2的蛋白水平很高，在生發中心Bcl-2 的mRNA水平很高，但幾乎檢測不到其蛋白的表達，證明確實存在轉錄后調控方式[4-6]，抑制翻譯進行的元件在不影響轉錄蛋白的情況下，下調此蛋白的翻譯水平。在不同的組織，不同的細胞中，可能存在著不同的轉錄調控模式。

其次，Bcl-2 家族蛋白成員眾多，其他成員如Bax、Bad、Bik等可以單獨參與細胞凋亡調控，也可以和Bcl-2形成異源或者同源二聚體，使其抑制細胞凋亡的活性下降，說明Bcl-2在細胞凋亡中的作用不是獨立的、單一的。研究顯示，形成同源二聚體的Bcl-2和Bax促進細胞凋亡，但形成異源二聚體的Bcl-2和Bax抑制細胞凋亡，所以研究Bcl-2/Bax比值的高低變化對細胞凋亡更有意義。這一理論在急性白血病患者凋亡調控基因的相關研究中得以證實[7]。同樣，Bcl-2/Bcl-xl可以抑制Bak/Bax，而Bad可以抑制Bcl-2/Bcl-xl，Bid，Bim不僅可以抑制Bcl-2/Bcl-xl，而且可以激活Bak/Bax。Bcl-2家族成員之間的相互作用受到抗體水平和親和力的影響。并且受到許多細胞因子、轉錄因子的調控，其機制錯綜復雜[8]。

回顧既往CMS細胞凋亡機制相關的研究，也有很多不同的實驗結果。追溯其原因，其中之一是選取病例的標準、骨髓采集和檢測方法的差異。在張朝霞等[9]研究中，CMS患者的骨髓組織通過骨髓活檢術采集，用免疫組織化學SP法檢測骨髓組織中Bcl-2、Bcl-xl等蛋白的表達，與本實驗的標本采集來源、實驗方法均不同。骨髓活檢組織與骨髓液的不同點在于骨髓組織保持了造血組織的天然結構，有核細胞群集，其內分布著各類造血細胞、間質細胞，以及多種蛋白、細胞因子等。Bcl-2 基因的轉錄調控研究顯示許多生長因子和細胞因子可以調控Bcl-2 的表達。骨髓活檢所獲取的骨髓組織中內容較豐富，可能有目前不可知的某些因素對Bcl-2 的表達存在影響。因此，骨髓組織中Bcl-2家族蛋白的表達，與本研究單純研究骨髓有核紅細胞的凋亡蛋白變化之間存在一定差異。陳揚揚等[10]的研究中將骨髓有核紅細胞分離出來后進行體外培養，檢測培養后的有核紅細胞中凋亡相關蛋白表達，其結果與本研究的結論不一致，考慮細胞離體后相對于復雜的機體，細胞培養僅僅是一種模擬狀態，體外細胞培養很難建立與人體條件接近甚至相似的環境[11-12]，故體外培養的有核紅細胞與骨髓液中的有核紅細胞必然存在差異，這也是結果不同的原因之一。本研究經過多步驟實驗，最終的研究對象是CD71+骨髓有核紅細胞，繼而測得骨髓有核紅細胞的Bcl-2家族mRNA表達水平。CD71是有核紅細胞表面表達的重要抗原標志之一，特別是在早幼、中幼紅細胞等紅系前體細胞中有更高水平的表達，隨著有核紅細胞進一步分化成熟CD71抗原表達逐漸下降，成熟紅細胞表面無CD71抗原表達，因此用CD71+細胞來代表骨髓有核紅細胞，具有特異性，亦更有價值、更可靠[13]。相對于體外培養的骨髓有核紅細胞，本研究更接近人體實際情況。

本研究中CMS組與對照組外周血Hb與骨髓有核紅細胞凋亡率及Bax mRNA表達水平均無相關性。此結論與前期的部分研究結果有所不同[14-18]，提示在CMS患者發病機制中有核紅細胞及成熟紅細胞的過度增殖仍可能是其主要的作用機制，而骨髓有核細胞凋亡可能對紅細胞的積累有一定的影響，今后還需加大樣本量，建立更加適宜的實驗模式，選取更可靠的實驗方法，繼續深入研究。

4 結 論

本研究以高原地區常見病CMS患者為研究對象，具有明顯的地域特色。本研究在既往實驗結果基礎上，采用流式細胞術及qPCR兩種不同的實驗方法，測定骨髓CD71+細胞(有核紅細胞)凋亡率，結果更接近實際情況。該研究的實驗結果與前人研究結果有所不同，可能與標本采集、研究方法等因素相關。在將來的研究中需要進一步擴大樣本量，運用多種不同的實驗方法進行研究，互相印證，取長補短，進而得出更加接近實際情況的結論，為CMS的預防及治療提供可靠的理論依據，繼而解決高原病所帶來的社會問題。