PD-1在類風濕關節炎外周血T淋巴細胞亞群表達的臨床意義*

段厚全，葉小英，葛 彥，居頌光△

(1.蘇州大學醫學部基礎醫學與生命科學學院免疫學系，江蘇蘇州215123；2.江蘇大學附屬昆山醫院檢驗科，江蘇昆山215300)

近年來程序性死亡配體-1(PD-1)備受大家關注，研究者們探討了PD-1在各種疾病中的作用[1]，PD-1作為負性共刺激分子在自身免疫性疾病中也發揮著關鍵作用[2-4]。類風濕關節炎(RA)是一種常見的自身免疫性疾病，其發病機制尙未明確，而PD-1可能在其發病機制中起重要作用。RA常見的臨床實驗室檢測指標有紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)、抗環瓜氨酸肽抗體(抗CCP抗體)、類風濕因子(RF)等，各項指標都有各自的優點及不足之處。本研究探討PD-1在RA外周血T淋巴細胞的表達情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集江蘇大學附屬昆山醫院2016年1-12月的RA患者78例，其中女68例、男10例；年齡19～77歲，平均(49.82±14.18)歲；其均已被江蘇大學附屬昆山醫院風濕免疫專科確診，并以類風濕關節炎患者評分(DAS28)[5]為標準將其分為活動期與緩解期(DAS28≥2.6為活動期，DAS28<2.6為緩解期)，其中活動期患者有44例，緩解期患者有34例，并追蹤觀察了其中的部分患者，2016年1-12月這些患者中有6例患者經治療由活動期轉為緩解期。另選取同期江蘇大學附屬昆山醫院體檢中心的體檢健康者31例為對照組，其中男3例，女28例；年齡22～71歲，平均(49.42±12.11)歲。統計兩組年齡、性別等差異無統計學意義(P>0.05)。排除感染、腫瘤、其他自身免疫性疾病和風濕免疫性疾病及其他骨關節疾病。

1.2儀器與試劑 主要試劑：FITC-標記小鼠同型對照、FITC-Mouse Anti-Human CD3、PE-Mouse Anti-Human CD4、PE-Mouse Anti-Human CD8、FITC-Mouse Anti-Human PD-1均由美國BD Biosciences 公司生產。主要儀器： BD FACSCalibur流式細胞儀(美國)。

1.3試驗方法 抽取對照組及RA患者靜脈血2 mL于EDTA-K2抗凝真空采血管中，其均在清晨空腹時采集。使用BD FACSCalibur流式細胞儀對樣本進行檢測，所有樣本均在6 h內檢測完畢，其具體實驗步驟如下。

1.3.1加抗體 取8根BD FACSCalibur流式細胞儀專用配套試管，第 1 管不加任何試劑作為陰性對照，其余試管內分別加入對應的FITC-Mouse Anti-Human CD3 抗體、 PE-Mouse Anti-Human CD4抗體、PE-Mouse Anti-Human CD8抗體和FITC-Mouse Anti-Human PD-1抗體。

1.3.2加血及染色 取患者靜脈血50 μL加入每根試管中，充分震蕩混勻，室溫(25 ℃)避光染色15 min。

1.3.3溶血 在每根試管中加溶血素1 L，振蕩混勻后避光保存在室溫(25 ℃)下15 min，使其充分溶血。

1.3.4離心及上機檢測 以2 000 r/min離心3 min；棄上清液后每管加入500 μL緩沖液，充分混勻后用BD FACSCalibur流式細胞儀進行檢測。

2 結 果

2.13組外周血中PD-1的表達水平比較 PD-1在RA患者外周血中的表達水平活動組高于緩解組和對照組，差異均有統計學意義(均P<0.01)，緩解組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，結果見表1和圖1、圖2。

表1 3組外周血中PD-1的表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與緩解組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2RA活動期CD4+PD-1+T、CD8+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較 在RA活動期CD4+PD-1+T細胞與CD8+PD-1+T細胞的陽性率高于ESR、CRP、RF，差異均有統計學意義(P<0.05)，而與抗CCP抗體陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3、表4。

表2 RA活動期CD4+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較[n(%),n=44]

注：與CD4+PD-1+T比較，*P<0.05，**P<0.01；-表示無數據。

2.3RA患者PD-1與ESR、CRP、抗CCP抗體的相關性 RA患者外周血PD-1的表達與ESR、CRP呈正相關關系(P<0.01)，與抗CCP抗體無相關(P>0.05)，結果見表2和圖3、圖4。

圖1 流式細胞術檢測3組外周血CD4+PD-1+T淋巴細胞

圖2 流式細胞術檢測3組外周血CD8+PD-1+T淋巴細胞

圖3 RA患者CD4+PD-1+T與ESR、CRP、抗CCP抗體的相關性比較

圖4 RA患者CD8+PD-1+T與ESR、CRP、抗CCP抗體的相關性比較

表3 RA患者中PD-1與ESR、CRP、抗-CCP的相關性

注：*P<0.05，**P<0.01。

表4 RA活動期CD8+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較[n(%),n=44]

注：與CD8+PD-1+T比較，*P<0.05，**P<0.01；-表示無數據。

2.4RA緩解期CD4+PD-1+T、CD8+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較 在RA緩解期CD4+PD-1+T細胞與CD8+PD-1+T細胞的陽性率高于ESR、CRP、RF，差異均有統計學意義(P<0.05),而與抗CCP抗體陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5、表6。

2.5同1例RA患者活動期與緩解期外周血PD-1水平比較 同1例RA患者其外周血PD-1水平活動期明顯高于緩解期，差異有統計學意義(P<0.01)，見表7。

表5 RA緩解期CD4+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較[n(%)，n=34]

注：與CD4+PD-1+T比較，*P<0.05，**P<0.01；-表示無數據。

表6 RA緩解期CD8+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較[n(%)，n=34]

注：與CD8+PD-1+T比較，*P<0.05，**P<0.01；-表示無數據。

表7 同1例RA患者活動期與緩解期外周血PD-1水平比較

注：與緩解組比較，*P<0.05。

3 討 論

至今RA的發病機制尚未完全明確，而眾多學者認為RA是T細胞介導的自身免疫性疾病，T細胞的活化在RA免疫病理過程中可發揮重要作用[4]。PD-1是重要的負性共刺激分子，其提供的負性共刺激信號在自身免疫性疾病中發揮重要作用[6-7]。有小鼠試驗也證實了PD-1的負性調控作用[8-9]。根據疾病活動度以DAS28評分[5]為依據可將RA患者分為活動期與緩解期，活動期DAS28≥2.6，緩解期DAS28<2.6。而本實驗探討PD-1在RA不同時期外周血T淋巴細胞的表達情況及其臨床意義。通過圖1及表1可看出，在RA外周血中CD4+PD-1+T%淋巴細胞活動期(38.83±10.30)明顯高于緩解期(25.36±4.51)高于健康對照組(21.60±4.27)(P<0.01)，緩解期高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，并且活動期增加得更明顯。這說明隨著RA病情的進展，疾病活動度越高病情越嚴重，則CD4+PD-1+T淋巴細胞的表達就越高。這一現象在其他學者的研究中也有體現[4，10]。從圖2和表1中可以看出，在RA中CD8+PD-1+T淋巴細胞與CD4+PD-1+T淋巴細胞有相同的表現，其在RA活動期(29.71±6.98)高于緩解期(21.19±4.51)和健康對照組(16.81±3.74)，其差異均有統計學意義(P<0.01)，這說明CD8+PD-1+T淋巴細胞隨著RA病情的進展也是逐漸增高的[4,11]。為了進一步證實這一結果，本研究追蹤了部分患者并發現同1例RA患者其CD4+PD-1+T細胞和CD8+PD-1+T細胞在疾病活動期明顯高于緩解期，差異具有統計學意義(P<0.01)(表7)，這也更加說明PD-1在RA的發病病理機制中可能起重要作用。由以上數據分析可見在RA中其外周血PD-1的變化能很好地反映RA患者病情的變化情況[12]。

該研究統計了RA患者的CRP、ESR等指標，并與其外周血PD-1進行了比較。由表2及圖3可見，CD4+PD-1+T淋巴細胞與CRP、ESR等臨床檢測指標呈正相關關系(P<0.01)，而與抗CCP抗體無明顯相關性(P>0.05)；由表2及圖4可見，CD8+PD-1+T淋巴細胞與ESR、CRP呈正相關關系(P<0.01)，而與抗CCP抗體無明顯相關性(P>0.05)。ESR與CRP是計算RA疾病活動度(DAS28評分)的重要因子[5]，與疾病活動度密切相關，而PD-1也與疾病的嚴重程度密切相關[13-14]，所以PD-1與ESR和CRP呈正相關關系(P<0.01)。PD-1與抗CCP抗體無明顯相關,可能與其在RA中的作用特點有關，抗CCP抗體是由RA患者的B細胞分泌產生的一種特有的氨基酸肽，對RA具有較高的特異度，在RA的早期診斷中重要價值[15-16]，但PD-1是負性調控分子，為了抑制RA患者T細胞的大量活化，PD-1會高水平表達，并隨RA病情的進展呈逐漸上升趨勢，與疾病的嚴重程度密切相關[13-14]，其在RA發病機制中可能扮演有重要角色，故其在判斷病情變化方面比抗CCP抗體更有優勢，所以抗CCP抗體可作為RA的早期診斷指標，而PD-1可考慮作為RA的病情分析指標。

通過觀察本文發現有一部分患者在其疾病活動期時其CRP、ESR、RF等檢測指標也為陰性，但實際上機體已受到免疫損傷，這時只檢測上述指標就會對病情判斷產生誤導，而PD-1能更好地反映患者的免疫狀況，檢測PD-1可以很好地彌補這一缺陷。因此,本研究對比分析了RA患者外周血PD-1的陽性表達率與RF、CRP、ESR和抗CCP抗體的陽性率。通過表3與表5可見,CD4+PD-1+T淋巴細胞在RA活動期與緩解期的陽性率均高于RF、CRP、ESR等指標；通過表4與表6可見,CD8+PD-1+T淋巴細胞在RA活動期與緩解期的陽性率也高于RF、CRP、ESR等指標。通過上述結果可見,PD-1在RA外周血中的陽性表達率高于RF、CRP、ESR等指標，所以檢測外周血PD-1有利于疾病的分析及病情判斷。分析其原因可能是由于PD-1是負性共刺激分子，能直接調控T細胞的活化程度和生存狀態[17]，是RA病理過程的直接和關鍵調控分子；而CRP等常用的臨床實驗室檢測指標是免疫細胞在免疫應答過程中才產生的炎性因子或抗體，屬于體液免疫，從免疫病理過程角度考慮其屬于下游分子，因此PD-1能更精準地反映RA患者的病情變化[4]。

4 結 論

PD-1在RA患者外周血中高表達并與疾病嚴重程度密切相關，PD-1與CRP、ESR等檢測指標密切相關，并且其陽性表達率高，PD-1可能在RA的免疫病理機制中起重要作用，檢測患者外周血PD-1水平對RA的臨床診斷與治療、病情觀察等都有積極意義，故PD-1作為新的臨床檢測指標用于RA有一定的應用前景。