引起耳道感染的產生物膜銅綠假單胞菌的流行病學分析*

葉麗艷，王 玥，宋林鍵，趙 強，楊繼勇，王成彬，羅燕萍△

(1.解放軍總醫院第一醫學中心醫學檢驗中心，北京 100853；2.重慶醫科大學檢驗醫學院，重慶 401331)

耳道感染是耳鼻喉頭頸外科中一類常見的疾病，病原菌(如真菌或細菌等)引起的感染是其發生和發展的主要因素。耳道感染主要包括外耳道炎和中耳炎，其中中耳炎是臨床上最常見的、影響人群量最大且常造成反復感染的感染性疾病，久治不愈可影響中耳功能與結構，嚴重者可導致顱內并發癥的發生[1]。研究顯示,在引起耳道感染的需氧菌中位于首位的革蘭陰性桿菌為銅綠假單胞菌(Pae)，由于抗菌藥物濫用現象極為普遍，使得Pae的種類與耐藥劑量不斷變化出現強耐藥性[2-5]。目前研究可知Pae耐藥機制主要為產生抗菌藥物滅活或修飾酶、改變抗菌藥物作用靶位、膜通透性障礙、主動外排系統及形成生物膜[6]。其中形成生物膜導致的耐藥較為普遍[7]，細菌生物膜給細菌的生存提供了很強的保護屏障，絕大多數的細菌存在主要生物膜，以此來抵御抗菌藥物的作用[8]。有報道細菌生物膜與慢性感染關系密切[9]，而在常見的革蘭陰性菌中，Pae是細菌中極易形成生物膜的一個菌種[7]，因此，研究耳道感染中Pae的生物膜形成對臨床上常見的耳道感染疾病的治療有很重要的意義。

1 材料與方法

1.1標本來源 解放軍總醫院2013年5月至2017年12月耳鼻喉外科耳道感染患者標本中分離的Pae 106株，同一患者同一標本類型來源選取初次分離株。質控菌株為Pae ATCC27853(美國模式培養物集存庫)，接種菌種到營養肉湯中進行活化,37 ℃培養18～24 h,備用。

1.2儀器與試劑 實驗儀器：Vitek MS質譜儀(生物梅里埃公司，法國)，Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定藥敏儀(生物梅里埃公司,法國)，酶標儀(SM-Mk3)，微量移液器，生物安全柜，96孔平底組織培養板，電子分析天平。實驗試劑：胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，結晶紫(2.00%)，乙醇(95.00%)，無菌生理鹽水，葡萄糖分析純粉末，殼聚糖季銨鹽粉末。

1.3方法

1.3.1分離培養、鑒定、藥敏 臨床樣本按《全國臨床檢驗操作規程》進行分離培養,采用法國生物梅里埃公司Vitek MS質譜儀進行菌種鑒定，采用Vitek 2 Compact GN09藥敏卡進行藥敏試驗。

1.3.2生物膜形成能力測定 參照文獻[10]，利用96孔平底組織培養板中Pae所形成的生物膜經結晶紫染色后，使用酶標儀檢測570 nm下的吸光度(A)值(每株細菌包括3個平行孔，每個96孔平底組織培養板包括3個空白對照)，并記錄。同樣參照文獻所述方法根據A值對每株Pae生物膜形成能力進行等級劃分。Ac=3×A空白對照標準差+A空白對照平均值。

在96孔平底組織培養板上構建Pae生物膜，并通過結晶紫染色、酶標儀測定對生物膜形成能力進行定量與定性分析，并且分析生物膜形成能力與Pae耐藥性之間的關系。

1.3.3生物膜形成影響因素 隨后選取11.10 mmol/L葡萄糖和15.00 μg/mL殼聚糖季銨鹽加入到生物膜形成因素研究中，探究這兩種因素是否與生物膜形成有關。

1.3.4生物膜形成能力的分級判定 生物膜形成情況按照參考文獻[10]方法進行分級判定：0級(A≤Ac)，無成膜能力；1級(Ac

1.4統計學處理 采用MiniTab17.0軟件進行統計分析,采用χ2檢驗,細菌耐藥數據分析應用Whonet 5.6軟件,按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2016-M100的折點標準進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1病例資料分析

2.1.1性別、年齡分布 在106例由Pae引起的耳道感染病例中，男31例，女75例。年齡分布以41～50歲為主，占23.60%，見表1。

表1 病例的性別、年齡分布

2.1.2耳道感染病例復發情況 在106例由Pae引起的耳道感染病例中，復發患者64例，未復發患者42例，復發率為60.38%。

2.2生物膜形成情況 在106株Pae中，形成生物膜的菌株占80.20%；生物膜形成能力以1級為主(46.20%)；復發病例分離的菌株中可形成生物膜的菌株比例(81.25%)高于未復發病例分離的菌株(78.57%)，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3抗菌藥物敏感度分析

2.3.1不同生物膜形成能力菌株的藥物敏感性分析 引起耳道感染的Pae對常見抗菌藥物的敏感率均在50.00%以上(除氨曲南47.17%外)，其中阿米卡星最高(94.34%)，其次是頭孢吡肟(88.68%)、頭孢他啶(86.79%)、美羅培南(80.19%)、亞胺培南(75.47%)。不同生物膜形成能力的Pae在臨床常見抗菌藥物中的藥物敏感率雖然沒有明顯差異，但產生物膜菌株的亞胺培南、頭孢他啶和左氧氟沙星敏感率比未產膜菌株敏感率略高，見表3。

表2 106株Pae生物膜形成能力情況

表3 生物膜形成能力及不同生物膜級別菌株的藥物敏感率比較

2.3.2復發組與未復發組分離菌株的藥物敏感率比較 復發組與未復發組菌株的抗菌藥物敏感率比較差異均無統計學意義(P>0.05)，復發組的頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林、氨曲南和頭孢哌酮/舒巴坦的抗菌藥敏感率略高于未復發組，見表4。

表4 復發組與未復發組分離菌株的藥物敏感率比較

續表4 復發組與未復發組分離菌株的藥物敏感率比較

2.4生物膜形成的影響因素分析 在生物膜構建的環境中分別加入11.10 mmol/L葡萄糖及15.00 μg/mL殼聚糖季銨鹽后測定Pae生物膜形成情況，并與原始生物膜形成結果進行比較。

2.4.1生物膜形成A值變化比較 11.10 mmol/L葡萄糖可以促進生物膜的形成，A值平均增加1.843；而15.00 μg/mL殼聚糖季銨鹽可起到一定的抑制作用，A值平均降低1.936。

2.4.2生物膜形成能力等級變化比較 11.10 mmol/L葡萄糖可以使73.60%的菌株生物膜形成能力提升，以等級上升1級為主(44.30%)，上升3級的較少(0.90%)；15.00 μg/mL殼聚糖季銨鹽對50.00%的菌株起到了抑制生物膜形成的作用，其中以下降1級為主(37.70%)。

3 討 論

耳道感染在耳鼻喉頭頸外科疾病中極為常見,Pae作為耳道感染中分離率最高的革蘭陰性致病菌，近年來受到廣泛關注。在其耐藥機制中，生物膜的形成是其逃逸藥物作用的常見方式[8]。有學者認為，形成生物膜可能是耳道感染反復發作、久治不愈的原因之一[1，11]。因此，對引起耳道感染的Pae相關特征進行研究,對了解疾病的發生、發展及優化臨床治療方案都有很深遠的意義。

解放軍總醫院共收集到引起耳道感染的Pae 106株，患有耳道感染的患者以41～50歲年齡段相對較多，以女性為主。Pae引起耳道感染的病例復發率達60.38%。在復發組與未復發組菌株比較中發現，復發病例分離菌株的產生物膜情況略高于未復發病例分離菌株，另外復發病例分離菌株對臨床常用的抗菌藥物(頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林、氨曲南和頭孢哌酮/舒巴坦等)敏感率略高于未復發病例分離菌株，可見中耳炎的復發與Pae的產生物膜情況及敏感率雖沒有直接關系，但菌株的生物膜產生在其中發揮著一定的作用，中耳炎的復發可能受多個因素的共同影響[12]，這也是筆者下一步將要研究的內容。

分離的Pae菌株具有形成生物膜的能力高達80.20%，其生物膜形成能力以1級和2級為主，與相關報道基本一致[13]。引起耳道感染的Pae對常見抗菌藥物的敏感率均在50.00%以上(除氨曲南47.17%外)，不同生物膜形成能力的Pae對臨床常見抗菌藥物體外敏感率雖然沒有明顯差異，但是在亞胺培南、頭孢他啶和左氧氟沙星3種抗菌藥物上，產生物膜菌株的敏感率比未產膜菌株敏感率略高，可見是否產生物膜對細菌的耐藥性影響不大，與文獻報道的略有差異[1]?？赡茉驗椋?1)Pae耐藥機制較復雜，且易發生多重耐藥[14]；(2)Pae生物膜產生過程較為復雜，受細菌生長的微環境、群體感應系統及與表型相關的基因調控[15]。

在生物膜形成的影響因素研究中，本文發現葡萄糖和殼聚糖季銨鹽對Pae生物膜的形成分別有一定促進和抑制作用，這與相關文獻基本一致[13,16-17]。國內外一些學者報道，糖尿病是醫院內泛耐藥Pae感染的獨立危險因素[18]，這可能與高血糖等代謝紊亂可使中性粒細胞功能下降及表面黏附因子增加，有助于微生物聚集形成生物膜有關。在本研究和相關文獻中可以看出，葡萄糖對生物膜的形成有促進作用[16]，且水平越高促進作用越強[13]；殼聚糖季銨鹽對Pae生物膜的形成有一定抑制作用，這與相關報道基本一致[17]。因此，控制血糖或使用殼聚糖季銨鹽凝膠對生物膜的抑制將起到一定效果。

4 結 論

引起耳道感染的Pae生物膜形成能力較強，控制血糖水平在正常范圍及使用殼聚糖季銨鹽凝膠對抑制生物膜形成有一定的作用，這對于預防疾病復發有一定的作用。