基于GEO數(shù)據(jù)庫篩選垂體泌乳素瘤發(fā)生的關鍵差異基因

鄭詩豪 張 揚 楊 波 陳忠儀 黃紹崧 黃繩躍

福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001

垂體泌乳素瘤是最常見的垂體功能性腺瘤，占垂體腺瘤總數(shù)的32%～66%[1]。據(jù)國外文獻報道，垂體泌乳素瘤的發(fā)病率約為27人/(百萬人·年)[2]。雖然發(fā)病率較低，但其是患者性欲減退、不孕，女性月經(jīng)不規(guī)律、溢乳，男性勃起障礙的最常見病理原因[3]。臨床上治療手段包括多巴胺激動劑卡麥角林和溴隱亭為主的藥物治療、手術切除以及放射治療，從而達到縮小腫瘤、降低血高泌乳素水平、保存垂體前葉功能的治療目標[4-5]。雖垂體泌乳素瘤被認定為良性腫瘤，但由于部分患者耐藥、特殊的激素分泌紊亂、術后再次復發(fā)概率大等問題，給臨床診治帶來一系列挑戰(zhàn)[3，6]。

隨著分子生物學理論和技術的發(fā)展，靶向藥物治療已經(jīng)成為當今腫瘤研究的熱點[7]。在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，隨著部分腦腫瘤的分子生物學發(fā)生機制被逐步闡明，2016版的WHO分類標準中首次引入了分子學特征對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤進行分類，標志著神經(jīng)腫瘤的診斷邁入了精準醫(yī)學的大門，對患者的治療和預后有重大意義[8]。而在泌乳素瘤中，ZHANG等[9]發(fā)現(xiàn)高表達的溶質蛋白運載家族2、促葡萄糖轉運載體11、嗜鉻粒蛋白B可能在泌乳素瘤的發(fā)展中起重要作用。FARAONI等[10]發(fā)現(xiàn)轉化生長因子β1系統(tǒng)可能參與泌乳素瘤進展。ZHONG等[11]發(fā)現(xiàn)京尼平(genipin)在泌乳素瘤細胞中可促進上調EGR1和P21的表達，并抑制泌乳素瘤細胞的增殖和遷移，是一種可能治療泌乳素瘤的潛在藥物。雖然越來越多的研究已集中在泌乳素瘤的發(fā)生、發(fā)展的分子層面，但目前人們對其具體機制的了解仍十分有限。因此，闡明泌乳素瘤發(fā)病機制，從而發(fā)現(xiàn)療效更好、不良反應更少的新治療策略顯得尤為重要[6]。

本研究通過對選出的GEO芯片中泌乳素瘤和正常垂體樣本的基因表達譜進行生物信息學分析，為進一步探究泌乳素瘤發(fā)生的潛在機制提供分子基礎，為泌乳素瘤的治療提供可能的新靶點。

1 資料與方法

1．1基因表達譜數(shù)據(jù)的選擇與獲取從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇編號為GSE119063的人泌乳素瘤組織表達譜芯片，該芯片基于GPL13607平臺Agilent-028004 SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray檢測。由5例垂體泌乳素瘤組織樣本和4例正常腦垂體組織樣本組成。提取該芯片中泌乳素瘤與正常對照垂體組織的基因表達數(shù)據(jù)，用于后續(xù)進一步分析。

1．2差異基因的提取與分析使用R軟件(版本號為3．6．2)，利用limma包對各個基因表達譜間數(shù)據(jù)進行歸一化處理，消除非實驗因素帶來的誤差。設置差異基因篩選條件：差異倍數(shù)>4倍且P<0.01(logFold Change>2 & adjustP<0.01)，得出符合條件的泌乳素瘤與正常腦垂體芯片中的差異基因。應用R軟件相關函數(shù)可視化篩選出的差異基因，繪制出火山圖及熱圖。

1．3差異基因的功能富集和注釋分析對差異基因進行GO功能注釋和KEGG功能富集分析。使用R語言軟件函數(shù)，設置P<0.05為條件，得出差異基因功能注釋的GO結果，該結果由生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個方面組成。

將以上篩選出的關鍵差異基因導入DAVID 6.8在線分析網(wǎng)站進行KEGG信號通路分析，將下載分析結果導出后，應用R軟件的ggplot2包按照條件P<0.05條件篩選出排名前10的通路。

1．4構建差異基因間蛋白質-蛋白質相互作用關系圖利用STRING網(wǎng)站分析差異基因間蛋白質的互相作用關系，在線生成蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖(protein proteininteraction network，PPI network)。統(tǒng)計PPI網(wǎng)絡中各蛋白之間的關系對數(shù)，按照關系對數(shù)數(shù)目排序，取前20個的蛋白，篩選出與垂體泌乳素瘤相關的關鍵差異基因。

2 結果

2．1芯片中垂體泌乳素瘤與正常垂體組織間顯著差異基因的篩選應用R軟件中l(wèi)imma和impute包，在篩選條件：logFold Change>2 & adjustP<0.01，得出差異基因279個，與正常垂體組織相比，泌乳素瘤中表達上調的基因數(shù)目23個，表達下調的基因數(shù)256個(表1)。將篩選出的差異基因繪制火山圖，并選取差異最顯著的前150個基因繪制熱圖(圖1)。

2．2差異基因的功能富集和注釋分析使用R語言進行GO功能注釋分析，分別取生物學過程、細胞組分以及分子功能前10個條目以條形圖的形式展現(xiàn)(圖2A)。在BP上與視覺系統(tǒng)發(fā)展、生殖系統(tǒng)發(fā)展、感官系統(tǒng)發(fā)展、膠質細胞生成、上皮細胞增殖、胚胎器官發(fā)育、呼吸系統(tǒng)發(fā)展相關；在CC上與細胞外基質膠原、內質網(wǎng)腔、肌動蛋白基細胞投射簇、微纖維和刷狀緣有關；在MF上與受體配體活動、細胞外基質結構組成、激素的活動、生長因子活性、同向轉運運動、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、電解質同向轉運活動、胰島素樣生長因子、生長因子結合、跨膜受體蛋白激酶活性等相關。

利用DAVID 6.8在線分析工具對上述關鍵差異基因進行KEGG信號通路分析，得到11個KEGG信號條目。運用R語言取P<0.05且最顯著的前10個條目以氣泡圖顯示(圖2B)，包括TGF-β signaling通路、干細胞多能性調控信號通路、視黃醇的新陳代謝通路、刺激神經(jīng)組織的中交互刺激通路、細胞色素P450對外源性藥物代謝通路等

圖1 芯片數(shù)據(jù)的處理結果 A：歸一化前不同基因表達譜芯片的中位數(shù)值不一致，存在較大誤差；B：歸一化后，各表達譜芯片中的中位數(shù)在同一水平上，消除了其他干擾實驗的誤差；C：火山圖展示了芯片中的差異基因，對比正常垂體組織，其中紅色的點代表泌乳素瘤高表達的基因，綠色的點代表泌乳素瘤中低表達的基因；D：聚類熱圖展示了差異最顯著的前150個基因，紅色代表高表達信號，綠色代表低表達信號Figure 1 Processing results of chip data.A：Before normalization，the median values of microarrays with different gene expression profiles were inconsistent，resulting in large errors；B：After normalization，the median in each expression profile chip is at the same level，eliminating the error of other interference experiments；C：The volcano diagram shows the differential genes in the microarray，comparing the normal pituitary tissues，where the red dots represent the genes with high expression in prolactioma and the green dots represent the genes with low expression in prolactioma；D：The cluster heat map shows the first 150 genes with the most significant differences，with red representing high expression signal and green representing low expression signal

2．3蛋白相互作用網(wǎng)絡分析利用STRING網(wǎng)站構建PPI網(wǎng)絡，將差異基因導入在線分析網(wǎng)站，設置條件interaction socre<0.4，并剔除孤立的節(jié)點，得出蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖，該圖由388個節(jié)點和205個蛋白相互作用對構成。根據(jù)計算每個蛋白的作用對數(shù)，得出前20個關鍵基因，如SOX2、PAX6、SOX9、POMC、WNT5A、GNC8、CCK、IGFBP3等(圖3)。

圖2 差異基因的功能分析 A：差異基因GO富集分析結果；B：差異基因KEGG通路富集分析結果Figure 2 Functional analysis of differential genes.A：GO enrichment analysis results of differential genes；B：Enrichment analysis results of differential gene KEGG pathway

圖3 差異基因蛋白與蛋白互相作用網(wǎng)絡 A：利用STRING網(wǎng)站構建差異的蛋白互相作用網(wǎng)絡圖；B：根據(jù)蛋白之間臨近相互作用對計數(shù)，選取前20個關鍵差異基因Figure 3 Protein-protein interaction network of differential genes A：Using the STRING website to construct the network diagram of different protein interactions；B：The first 20 key differentially expressed genes were selected based on the pairs of adjacent interactions between proteins

表1 利用R語言中l(wèi)imma包篩選出泌乳素瘤組織與正常垂體組織的差異基因Table 1 Differential genes between prolactioma tissues and normal pituitary tissues were screened by using the limma package in R language

3 討論

垂體泌乳素瘤是一種分化良好的腫瘤，但由于其具有分泌激素的功能，可導致患者產(chǎn)生明顯的內分泌綜合征，此外，腫瘤不斷生長壓迫正常腦組織也會引起相應的神經(jīng)功能缺失[12]。盡管口服多巴胺激動劑和選擇性切除泌乳素瘤是目前主要的臨床治療方法[13]，但其相關的不良反應仍不容忽視[14]。部分患者的藥物耐藥性及手術切除本身的風險、術后腫瘤復查等問題一直是擺在醫(yī)生面前的重大難題[15-16]。近年來，對泌乳素瘤的研究逐漸增多，但對于其發(fā)生的分子機制仍知之甚少。分子層面的研究有助于了解疾病的發(fā)病機制，并可能通過識別新的生物標志物改變疾病的整個治療方案，并獲得更好的預后[17-18]。本研究為闡明泌乳素瘤的發(fā)生發(fā)展機制提供了可靠的研究數(shù)據(jù)和可能的治療新靶點。

本研究通過分析GSE1190635中5例垂體泌乳素瘤組織樣本和4例正常腦垂體組織樣本基因表達譜芯片，篩選出279個差異表達基因。差異基因GO功能注釋分析表明，在細胞成分上，差異基因主要集中在膠原組成的細胞外基質、內質網(wǎng)內腔、肌動蛋白細胞簇；在生物學過程中主要體現(xiàn)在呼吸、生殖、感官及視覺系統(tǒng)的發(fā)展、膠質細胞、上皮細胞的生成；分子功能表現(xiàn)在受體配體活動、細胞外基質結構組成、生長因子的活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、胰島素樣生長因子I等。差異表達基因主要涉及生長、代謝、生殖等調節(jié)功能，而這些功能是正常腦垂體的主要生理功能，因此，在泌乳素瘤中，這些功能可能受到不同程度的影響，導致異常癥狀的出現(xiàn)；此外，泌乳素瘤本身的腫瘤屬性也可能引起生長、代謝方面功能的變化[19-20]。可以通過GO分析結果解讀泌乳素瘤相關的生物學過程，如泌乳素瘤患者普遍存在葡萄糖、膽固醇和甘油三酯間的代謝障礙[21]，這與胰島素功能的異常密切相關，其中胰島素負責抑制胰島素生長因子I[22]，與GO分析結果不謀而合，可以推斷胰島素生長因子I在泌乳素代謝變化中的聯(lián)系和重要性。

KEEG通路主要富集在TGF-β信號通路、干細胞多能性調控信號通路、視黃醇新陳代謝通路、細胞色素P450藥物代謝通路、細胞因子受體間相互作用通路等。ELENKOVA 等[23]發(fā)現(xiàn)，TGF-β是判定泌乳素瘤侵襲性的一個可靠血清標志物；LI等[24]提出TGF-β/Smad3通路在泌乳素瘤對多巴胺能藥物的耐藥中起重要作用；HU等[25]進一步證實TGF-β1/Smad3通路通過導致腫瘤細胞外纖維化從而引起泌乳素瘤耐藥。腫瘤干細胞與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)等生物學過程密切相關，且與放化療的耐藥性相關，在良性腫瘤分離出腫瘤干細胞并不常見。GAO等[26]在人和大鼠泌乳素瘤中均發(fā)現(xiàn)存在表達干細胞標志物的細胞，而且在表達干細胞標志物CD133的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了對多巴胺能藥物耐藥的情況。視黃醇代謝的視黃酸在垂體組織的正常發(fā)育和功能維持中起重要作用，同時也是垂體前葉細胞的調節(jié)因子。FUJIWARA等[27]發(fā)現(xiàn)，在大鼠模型中，局部視黃酸的減少與泌乳素瘤細胞的增殖有關。細胞色素P450酶已被證實在泌乳素瘤組織中表達，且表達程度與腫瘤的侵襲性相關[21，28]。

根據(jù)蛋白互相作用關系篩選出前20個關鍵差異基因，其中SOX2作為干細胞標志物，已被GAO等[26]在人和大鼠的泌乳素瘤組織發(fā)現(xiàn)，而有研究報道垂體腺瘤中的POMC表達明顯高于垂體[29]。余下基因目前尚未見在泌乳素瘤中的報道。這些關鍵基因有可能在垂體泌乳素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用，有望成為泌乳素瘤治療的新靶點。

本研究利用GEO表達譜數(shù)據(jù)篩選出了泌乳素瘤與正常垂體組織中差異基因，通過富集分析探討了其可能的分子機制，并通過蛋白互相作用網(wǎng)絡分析得出關鍵作用差異基因。目前，世界上對于泌乳素瘤的分子機制研究十分匱乏[30]，本研究得出的關鍵差異基因鮮有報道。相信本研究結果將為后續(xù)研究者對泌乳素瘤的生物學過程的理解提供幫助，為尋找新的分子標志物提供參考研究對象，同時也為泌乳素瘤提供新的潛在治療靶點。