NKG2D配體在人腦膠質瘤細胞的表達及其在體外條件下對NK細胞殺傷活性的影響

張 鵬 韓偉杰 孫紅衛 黃德海

1)鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052 2)河南醫學高等?？茖W校，河南 鄭州 451191

近年來，免疫治療在腫瘤治療領域取得了革命性進展[1]。腫瘤的免疫治療于 2013 年被 Science 評為年度十大科技突破之首，為腫瘤治療帶來新的希望[2-5]。NK細胞是機體固有性免疫的主要組成細胞之一，在抗腫瘤、抗病毒、抗胞內寄生菌以及移植排斥反應中發揮著重要作用[6-7]。表達于NK細胞表面的NKG2D(natural killer group 2D) 是NK細胞識別、殺傷腫瘤細胞的最主要的殺傷活化受體[8-10]，其配體主要為腫瘤細胞表面的屬于非HLA-I類分子的UL16結合蛋白(UL16 binding protein，ULBP)家族(ULBP1、ULBP2、 ULBP3)和MHC-I類鏈相關分子(MHC class I chain-related molecule，MIC)(MICA、MICB)，這些配體分子主要存在于上皮細胞腫瘤以及白血病細胞系中[11]。人腦膠質瘤(human glioma cell，HGC)屬于神經上皮腫瘤，本文通過流式細胞儀技術探討NKG2D配體在HGC的表達情況，并進一步分析其在體外條件下NK細胞殺傷HGC效應中的作用。

1 材料與方法

1．1 HGC的分離、培養無菌狀態下取新鮮腫瘤組織塊約10 g，浸泡于DMEM/F12培養基，PBS液沖洗，剪切組織塊(0.5～1 mm3)，加入6倍體積的0.25%胰蛋白酶消化，并每隔3 min反復吹打、搖蕩腫瘤組織塊，消化至腫瘤組織塊分散為單個細胞或細胞團，10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，組織懸液用200目的不銹鋼絲網過濾；離心5 min，10%胎牛血清的DMEM/F12培養基懸浮離心沉淀；臺盼蘭染色法計算活細胞數及密度；3×105個/mL細胞的密度接種于培養瓶中；培養箱中培養；每2～3 d換液1次。觀察細胞生長情況和形態學改變。

1．2 NK細胞NK細胞的分離、純化及培養密度梯度離心法分離1例健康志愿者外周血單個核細胞，MACS法分選NK細胞；流式細胞儀檢測NK細胞純度。NK細胞培養于10%胎牛血清的RPMI 1640(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL，IL-2 1 000 U/mL)，以2×105/cm2細胞密度接種于培養瓶中，置37 ℃、5%二氧化碳的培養箱中，以培養24 h后的NK細胞作為效應細胞。

1．3 HGC表面的NKG2D配體的表達取處于對數生長期的HGC，以3 000 rpm離心10 min，PBS洗滌3次，細胞計數并分管，按每106個HGC細胞1 μg的量分別加入MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3分子抗體，對照管加入鼠抗人IgG1；4 ℃標記30 min；流式細胞儀分析每104個細胞中陽性細胞數，計算表達率。重復實驗3次，計算平均值。

1．4 NK細胞殺傷活性測定不同效靶比時NK細胞殺傷活性(MTT法)；抗體封閉試驗：取效靶比為50：1，在靶細胞孔分別加入anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP1、anti-ULBP2及anti-ULBP3單抗，室溫培養30 min后加入NK細胞，測NK細胞對HGC的殺傷活性。NK細胞殺傷活性(%)=(實驗組OD值-靶細胞自然釋放組OD值-效應細胞自然釋放組OD值)/(靶細胞最大釋放組OD-靶細胞自然釋放組OD)×100%。

1．5統計學處理應用SPSS 18.0軟件進行數據處理，NK細胞對HGC不同殺傷活性的比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2．1 NK細胞的純度分選后的NK細胞的純度達91.67%。

2．2 NKC2D配體在HGC的表達HGC表面表達NKG2D的配體MICA、ULBP2、ULBP3，不表達NKG2D的配體MICB、ULBP1(圖1)。MICA、ULBP2和ULBP3分子在HGC表面的表達率分別為63.52±6.67%、62.01±5.65%和51.36±2.38%，在HGC表面不表達MICB和ULBP1。

圖1 HGCs表面NKG2D的配體表達Figrue 1 NKG2D ligand expression of on HGCs surface

2．3NK細胞殺傷活性的測定及NKG2D配體對NK細胞殺傷活性的影響 MTT法結果顯示：當效靶比分別為10∶1、20∶1、50∶1及100∶1 時，NK細胞對HGC的殺傷活性分別為(23.58±1.69)%、(37.17±3.45)%、(49.69±4.31)%及(54.07±6.12)%。在各效靶比時(除效靶比50∶1組與效靶比100：1組間外)，NK細胞對HGC的殺傷活性在各組間差異均有統計學意義(P<0.05)。

效靶比為50∶1時，用anti-MICA、anti-ULBP2及anti-ULBP3分別對HGC表面相應的MICA、ULBP2及ULBP3分子進行封閉，NK細胞對HGC的殺傷活性分別為(40.86士2.14)%、(39.15士1.43)%和(37.88士2.35)%，與封閉前(49.63±4.28)%相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

NK細胞的細胞殺傷效應和其表面殺傷受體密切相關。依功能的不同，殺傷受體分為殺傷抑制受體和殺傷活化受體，前者誘導抑制NK細胞的殺傷活性，后者誘導NK細胞殺傷活性。NKG2D是NK細胞表面的重要殺傷活化受體之一，在樹突狀細胞、T細胞、巨噬細胞表面也有表達[12]。人NKG2D配體分為兩大類：MIC和ULBP家族，前者包括MICA和MICB，后者包括ULBP1、ULBP2和ULBP3[13-14]。

MIC基因位于經典的HLA-Ⅲ類基因區，是Ⅰ型跨膜蛋白。在正常細胞人體細胞中，MIC僅發現于腸黏膜上皮細胞表面，而幾乎所有的人上皮源性腫瘤均發現MIC分子的表達[15-16]。MIC是一種易于激活表達的基因，在一些腫瘤細胞、病原體感染細胞及應激細胞均可增強表達[17-19]。

ULBP家族編碼基因位于人染色體的6q25區的MHC之外的區域，其基因與MIC基因無關。ULBP1、ULBP2和ULBP3結構都與HLA-I類分子的α1、α2結構域有同源性，表達較廣泛，可見于多種細胞、組織和腫瘤。所有的ULBP家族成員都缺乏a3功能域，不能與抗原肽結合。

NKG2D配體的表達差異性很大，不同的腫瘤細胞表達可能不同；既使同一腫瘤不同的細胞系，NKG2D配體的表達也可不同。FUCHS等[20]研究發現，ULBP在不同的黑色素瘤細胞系表達有較大的差異。NKG2D與其配體識別所誘導的殺傷活化效應可以消除殺傷抑制受體誘發的NK細胞抑制性效應[17]。因此，NKG2D的活化程度一定程度上決定著NK細胞殺傷腫瘤細胞效應的水平。而這種活化程度是由效應細胞(腫瘤細胞)表面的NKG2D配體決定的，因此，增加效應細胞表面配體的表達是增強抗腫瘤效果的重要途徑之一。有研究用羥基脲誘導慢性髓性白血病細胞系OUN-1細胞表面的NKG2D配體的表達增加，從而增強NKG2D和其配體的相互作用介導的NK細胞對白血病細胞的殺傷效應[21]。

本研究表明，HGC表達NKG2D配體MICA、ULBP2及ULBP3分子，不表達MICB和ULBP1分子。因此任意個體的NK細胞都存在殺傷HGC的分子基礎。不同腫瘤細胞表達的配體不同，既使在不同的腫瘤中表達相同配體，由于配體數量的差異，NK細胞的效應也不同。NK細胞體外殺傷HGC的試驗顯示了NK細胞對HGC具有殺傷效應，且這種殺傷效應可以被相應的配體抗體所抑制。

本研究流式細胞儀檢測發現，在蛋白水平、HGC表面的MICA、ULBP2和ULBP3表達率分別為(63.26±6.71)%、(61.23±5.97)%和(51.47±2.43)%，但不表達MICB和ULBP1分子，NKG2D與靶細胞表面的MICA、ULBP2和ULBP3識別、結合而激發的殺傷活化效應可能是NK細胞殺傷HGC的主要機制之一。

在一定限度內，NK細胞對HGC的殺傷活性隨著效靶比升高而增強，即隨著NK細胞與HGC數量比值的增大，殺傷效應逐步增強，但當效靶比超過50∶1，增加的NK細胞的比例與取得的殺傷效應不成正比。50∶1組和100∶1組比較無顯著性差異。這可能與HGC表面配體數量的飽和性有關，即配體的數量是一定的，當配體與受體的識別和結合達到飽和后，增加殺傷受體的數量，不能增加NK細胞的殺傷效應。

用anti-MICA、anti-ULBP2及anti-ULBP3單抗分別阻斷HGC表面相應的MICA、ULBP2及ULBP3配體，NK細胞的殺傷活性受到不同程度的抑制，與阻斷前相比均有統計學意義(P=0.000)。說明NKG2D與配體間的相互作用確實參與NK細胞對HGC的殺傷效應。同時，抗體阻斷試驗只是部分阻斷NK細胞的殺傷活性，說明除了NKG2D介導的殺傷效應外，尚有其他信號通路參與NK細胞對HGC的殺傷作用。有學者在膠質瘤的體外抑制試驗發現了相似的的實驗結果。