Protamex 蛋白酶水解大豆蛋白制備啤酒糖漿復配液的研究*

周泓江 黃雋光 羅建勇 史一白 錢 芳， 黃立新*

1（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

2（廣州雙橋股份有限公司，廣東廣州 510280）

Protamex 復合蛋白酶是諾維信等生物技術公司從芽孢桿菌屬微生物開發生產的一種蛋白酶最適pH 值5.5～7.5，溫度35 ℃～60 ℃，是一種被廣泛應用的蛋白酶酶制劑。前期研究表明，用Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白，其水解液苦味相對較大，對其應用有不良影響，而Protamex 復合蛋白酶即使在低水解度下，水解液苦味不明顯，因此被用于酶解雞蛋蛋白、動物蛋白以及小麥、玉米和大豆等植物蛋白，以及保健食品和醫藥等領域。

在企業開發啤酒用糖漿和前期試驗基礎上，發現Alcalase 蛋白酶酶解大豆蛋白的水解原液存在一定的苦味。本文采用Protamex 蛋白酶在不同水解條件下酶解大豆蛋白，研究測定其大豆蛋白酶解液的蛋白質回收率、水解度、α－氨基酸含量、隆?。↙undin）區分的變化及其SDS-PAGE 凝膠電泳，探討水解制備大豆蛋白酶解發酵液條件，使之接近或相當于麥芽汁隆丁區分的一般要求：高分子含氮物質占25%，中分子含氮物質占15%，低分子含氮物質占60%，以期具有更好的風味，同樣能夠與啤酒用麥芽糖漿復配使用，更適于啤酒釀造。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆蛋白，山東香馳豆業科技有限公司；Protamex 蛋白酶，活力1.5 AU/g，諾維信公司。

1.2 儀器設備

PHS－3C 型pH 計；FA1004 電子分析天平；KHW-D-1 電熱恒溫水浴渦；79-3 型恒溫磁力攪拌器；JJ-1 增力電動攪拌器；KDN－2C 型凱氏定氮儀；KDN 型消化爐；TDL-5-A 型低速臺式離心機；DYCG-30 型電泳槽。

1.3 大豆蛋白酶解液的制備

1.3.1 步驟

準確稱量大豆蛋白，加入一定量蒸餾水，攪拌均勻，在80 ℃±2 ℃處理15 min，冷卻至預定溫度后恒溫水浴，調節pH 值至設定值。加入一定量的蛋白酶，配制成設定底物濃度的反應液，緩慢攪拌，反應過程用0.5 mol/L NaOH 溶液滴定維持體系在預定pH 值。反應到預定時間后，立即放入85 ℃水浴中加熱15 min 鈍化蛋白酶，冷卻后在4 800 r/min離心20 min，取上清液，于冰箱冷藏。采用pH-state 法測定大豆蛋白酶解過程的水解度（DH）。

1.3.2 裝置圖

大豆蛋白酶法水解的裝置簡圖，見圖1。

1.4 測定方法

1.4.1 干固物

圖1 制備大豆蛋白酶解液的試驗裝置簡圖

參照參考文獻［13］方法測定。

1.4.2 蛋白質

參照GB 5009.5 的標準檢測測定，換算系數為5.71。

1.4.3 可溶蛋白回收率（NR）

大豆蛋白粉水解后，計量水解離心后上清液的質量，準確稱取約1.000 g 的蛋白水解液，用凱氏定氮法消化、定氮，測定出上清液中蛋白含量，公式為：

式中：X——蛋白質回收率；

m1——上清液中蛋白質含量；

m0——底物蛋白質含量

1.4.4 SDS-PAGE 凝膠電泳

標準蛋白樣和未知樣品在同一塊凝膠上進行電泳，用標準蛋白遷移率與相對分子質量對數作圖，可以獲得一條mR-lgMr 標準曲線，根據未知蛋白遷移率，可得到未知樣品相對分子質量。

2 結果與討論

2.1 酶用量對大豆蛋白水解產物的影響

在底物質量濃度5%，反應溫度50 ℃，pH 值6.5，酶用量分別為750 U/g、1 000 U/g 和1 500 U/g條件下進行酶解。隨著水解的進行，體系pH 值逐漸下降，滴加0.5 mol/L 的NaOH 保持pH 值為6.5。取不同時間段水解液，測量其NR 值、DH 值，以及酶解液Lundin 分布和電泳后分子量分布，測定結果分別見下頁圖1～圖3。

由下頁圖1（b）可知，隨著酶用量和酶解時間增加，水解度呈現逐漸增加的變化趨勢。在水解初期，DH 值上升很快，2 h 后上升速度逐漸緩慢，基本保持穩定；當酶用量從750 U/g 增至1 000 U/g時，最終DH 值變化較小，對水解度影響減弱。

圖1 酶用量對可溶蛋白回收率和水解度的影響

由圖1（a）可知，隨著酶用量增加，NR 值相應增加，當酶用量大于1 000 U/g 時，NR 增加速率降低，與DH 值變化一致。反應時間為3 h 時，NR接近峰值，此后隨著時間的延長，NR 值有所減小。該水解是一個復雜的變化過程，在大分子蛋白被水解成小分子蛋白和多肽的同時，這些小分子蛋白和多肽經過相互作用，再次聚集成分子量稍大的蛋白質，使得NR 值減小。

由圖2 可知，C 區分在酶解時間超過2 h 后，其含量比例基本都超過60%；酶添加量為1 000 U/g和1 500 U/g，C 區分在酶解1 h 時，其含量比例均超過60%。在A 區分，隨著酶用量和酶解時間的增加，其含量比例下降明顯，酶用量的影響比較顯著；在酶用量相同時，Protamex 蛋白酶酶解大分子蛋白的能力比Alcalase 蛋白酶弱，其A 區分含量比例都相應較高。

圖2 酶用量對Lundin A、B 和C 區分分布的影響

圖3 不同酶用量隨反應時間變化所得酶解液的SDS-PAGE 凝膠圖譜

由下頁圖3 可知，隨著酶用量的增加，酶解液中大分子蛋白呈下降趨勢。當酶用量為750 U/g時，反應1.5 h 時仍然有分子量約30×104Da 的蛋白質分子；當酶用量為1 000 U/g，反應1.5 h 時，蛋白分子量幾乎都在2.5×104Da 以下；當酶用量達到1 500 U/g，反應1 h 后，酶解液中分子量都在2.0×104Da 以下。

綜合成本、NR 值、DH 值，以及反應所得酶解液的Lundin 分布和電泳圖的結果，選擇加酶量1 000 U/g 為宜。

2.2 pH 值對大豆蛋白水解產物的影響

在底物濃度5%，反應溫度50 ℃，酶用量1 000 U/g，pH 值分別在6.0、6.5、7.0 條件下反應，過程中滴加0.5 mol/L 的NaOH 溶液保持pH 值不變。取不同時間段的水解液，測量其NR 值、DH值，以及酶解液Ludin 分布和電泳后分子量分布，測定結果見圖4～圖6。

由圖4 可知，Protamex 屬于中性蛋白酶，在中性至微酸性條件下，水解效果較好。隨著pH 值的升高，NR 值也逐漸上升；反應初期，NR 值、DH值皆隨著反應時間的延長而升高；繼續酶解，DH值的增加減緩，到2 h 后趨于平緩；酶解3 h 時，NR 值達到最高值，隨后降低，原因可能是部分中小分子多肽重新發生了聚集。

圖4 pH 值對蛋白質回收率和水解度的影響

圖5 pH 值對LundinA、B 和C 區分分布的影響

由圖5 可知，pH 值對Protamex 蛋白酶的影響比Alcalase 的影響大。酶解pH 值增大，隨反應的進行，A 區分含量比例降低，C 區分含量增加，1 h后都超過60%。反應2 h～4 h 時，B 區分含量為15%左右。Protamex 對大豆蛋白的水解效果從蛋白的分子量分布上看優于Alcalase 蛋白酶，水解1 h時A 區分含量較接近發酵液要求。

圖6 不同pH 酶解下隨反應時間所得的酶解液的SDS-PAGE 電泳圖譜

由圖6 可知，當酶解pH 值為6.0 或7.0 時，反應2 h 后，在2.01×104～3.1×104Da 區間，依然有多條明顯的凝膠譜帶。在啤酒發酵過程當中，B 區分含量決定了啤酒持泡性和泡沫質量，對B 區分含量要求相對較高。因此，綜合考慮NR 值、DH 值和Lundin 分布等情況，選擇pH6.5 條件較為適合。

2.3 酶解溫度對大豆蛋白水解產物的影響

在底物濃度5%，酶用量1 000 U/g，pH 值6.5，分別在45 ℃、50 ℃、55 ℃條件下進行酶解，過程中滴加0.5 mol/L NaOH 溶液保持pH 值不變。取不同時間段的水解液，測量其NR 值、DH 值，以及酶解液Lundin 分布和電泳后分子量分布，測定結果見圖7～圖9。

由圖7 可知，溫度對NR 值、DH 值的影響變化一致，且影響都較顯著。Protamex 蛋白酶水解大豆蛋白的機理及動力學研究表明，酶解溫度為45℃～50 ℃水解效果較好。酶解溫度50 ℃時反應3 h可得到較高的蛋白質回收率值，為63.7%（濕基）。

圖7 反應溫度對蛋白質回收率和水解度的影響

由圖8 可知，在本試驗溫度條件下，酶解1 h～6h，所有酶解液的C區分都大于60%。與45℃和55 ℃相比，在50 ℃的酶解，其Lundin A 和B 區分含量比例最小，C 區分最大，酶解6 h 時，其C 區分含量超過80%，表明50 ℃的酶解效果較好。

圖8 溫度對酶解液LundinA、B 和C 區分分布的影響

酶解溫度為45 ℃時，A 區分含量隨酶解時間的延長而減少，B 區分含量則隨時間的延長而增加。酶解時間以1 h～6 h 時，B 區分含量從13%升至17.5%，表明B 區分中分子多肽水解為C 區分小分子肽的數量，小于A 區分高分子肽水解成B 區分中分子肽的數量。

酶解溫度為50 ℃和55 ℃時，A 和B 區分含量變化趨勢比較一致。其中，B 區分含量都隨酶解時間的延長，呈現先增加后減少的趨勢，在2 h 時，B 區分含量比例最大，接近或大于15%。

圖9 不同溫度條件下隨反應時間所得SDS-PAGE 電泳圖譜

從圖9 電泳圖可見，隨著溫度的增加，反應所得酶解液的分子量在3.0×104Da、2.0×104Da、0.6×104Da 均有分布，符合啤酒發酵液所要求的Lundin 分布。綜合考慮NR 值、DH 值、Ludin 分布等結果，酶解溫度控制在50 ℃～55 ℃之間較為適宜。

2.4 底物濃度對大豆蛋白水解產物的影響

在酶用量1 000 U/g，pH 值6.5，溫度50 ℃，底物濃度分別為4%、5%、6%和7%條件下酶解，過程中滴加0.5 mol/LNaOH 溶液保持pH 值不變。取不同時間段的水解液，測量其NR 值、DH 值，以及酶解液Lundin 分布和電泳后的分子量分布，測定結果分別見圖10、圖11。

圖10 底物濃度對蛋白質回收率和水解度的影響

由圖10 可知，4%～6%大豆蛋白質量濃度對NR值、DH 值的影響不大，大豆蛋白含量5%～6%的水解效率較高，以后隨著蛋白濃度的增大，酶水解效率逐漸下降。蛋白質量濃度超過7%，水解效果變得較差。但是，生產時提高濃度可以減少能耗、提高設備利用率，在保證達到所需水解度的條件下，可根據實際情況選用較高底物濃度。

圖11 不同底物濃度條件下隨反應時間所得的酶解液的SDS-PAGE 電泳圖譜

由圖11 可知，隨著底物濃度的增加，高分子含量的部分不斷增加，當底物濃度在5%時，分子量主要分布在0.7×104Da、1.8×104Da、2.0×104Da和2.8×104Da 左右，當底物濃度為7%的時候，分子量出現超過4.3×104Da 的部分。綜上所述，為了實現與麥汁組分相近的酶解液，選擇底物濃度為5%較為適宜。

3 結論

通過實驗可知，Protamex 酶對大豆分離蛋白有較好的水解效果。為了得到可以用于部分或全部替代麥汁的與糖漿復配的酶解液，所選取的酶解條件并不是最佳水解度的酶解條件。Protamax 蛋白酶水解大豆蛋白的產物，其分子量分布范圍較為廣泛，當反應時間在1.0 h～1.5 h 時，所得到的酶解液的Lundin 分布較為接近麥汁Lundin 區分分布的要求，而此時的NR 值也在63.7%（濕基）左右。因此，采用Protamex 酶來制取含氮復合糖漿的蛋白復配液是可行的。

Protamex 酶制取糖漿復配含氮酶解液的最佳條件是：底物濃度5%，酶用量1 000 U/g，溫度50 ℃，pH 值6.5，反應時間1.0 h～1.5 h。在此條件下所得的酶解液為淺黃色，略帶苦味，但弱于Alcalase 蛋白酶酶解大豆蛋白所得酶解液的苦味。