兩棲類皮膚石蠟切片樣本量探討
——以峨眉髭蟾毛細血管豐富度為例

許雙， 戴強， 張丕珠， 鄭渝池*

(1. 中國科學院成都生物研究所，成都610041； 2. 中國科學院大學，北京100049)

兩棲動物皮膚的功能包括離子及水交換(Bentley & Yorio，1979；Marrero & Hillyard，1985；Sullivanetal.，2000)、感覺(Kitson & Roberts，1983；Mearow & Diamond，1988)、機械與化學防御(Fox，1986；Evans & Brodie，1994；Woodhamsetal.，2007；Jeckeletal.，2015)和呼吸(Duellman & Trueb，1994；Nussbaum & Wilkinson，1995；Bickfordetal.，2008；Robischon，2017)。對皮膚各功能對應結構特征的量化常借助石蠟切片技術，涉及如分裂相表皮細胞比例(耿欣蓮，1959)、皮膚各層厚度(Grevenetal.，1995；Barrionuevo，2017；Yangetal.，2019)、腺體數量和大小(de Almeidaetal.，2007；Gon?alves & de Brito-Gitirana，2008；Yangetal.，2019)等。特征值的準確獲得受樣本設計影響。目前在石蠟切片技術領域，即使針對相同特征，已發表工作所采用的設計(包括切片數、測量數等)也少見統一(Norrisetal.，1989；劉滿櫻等，2007；李洋等，2009；Pratesetal.，2012；Brunettietal.，2016；Barrionuevo，2017；Ponssaetal.，2017；Wanningeretal.，2018)。例如皮膚各層厚度的測量，曹燕等(2011)對齒突蟾屬Scutiger4個物種背腹面等距測量5次，而Chammas等(2015)對疣蟾Rhinellagranulosa背腹面測量30次，Ponssa等(2017)對細趾蟾屬Leptodactylus物種背部不同部位測量5次，VanBuren等(2019)對白唇樹蛙Litoriainfrafrenata背腹及后肢腹面隨機測量10次。

不同結構特征的量化，緣其自身特點，對樣本設計的要求理當不同。實際工作中，同一批次石蠟切片樣品往往為不同特征提供數據。通過直接測量即可獲得數據的指標，如厚度可能需要較小的樣本量。而另外一些無法直接測量的特征則可能需要更大工作量的取樣，進而影響制備切片樣品的策略和工作量。因此，對后者樣本設計的探討有利于實踐工作。

皮膚氣體交換主要發生于表皮下毛細血管，其密度為衡量呼吸能力的一項重要參數(Krogh，1904；Feder & Burggren，1985；Malvin，1988，1993)。通過向兩棲動物活體心臟注射墨水，可染色毛細血管并測量其單位面積內的長度(Czopek，1965；de Saint-Aubain，1982)。但基于動物倫理的考量，該方法近年來已罕有使用，現常用石蠟切片計數評估皮膚毛細血管豐富度?；诿氀苡嫈岛颓忻骈L度，單條切片僅可提供一個豐富度值。為獲得有代表性的結果，需要相當的樣本量。在長時間完全沒入水中的情況下，一些蛙類有戰斗和鳴叫等依賴于高效率皮膚呼吸的行為，但其相應皮膚毛細血管特征尚待研究。這些蛙類中生活史和行為學研究開展較多的物種之一為峨眉髭蟾Leptobrachiumboringii(Zhengetal.，2011；Hudson & Fu，2013)。本研究以峨眉髭蟾10個部位表皮下毛細血管豐富度為例，通過對樣本進行重抽樣，探討取樣與結果穩定性的關系，以期為兩棲類皮膚切片的樣品制備策略提供參考。

1 材料與方法

峨眉髭蟾隸屬角蟾科Megophryidae，主要分布于四川盆地周邊山地，每年2—4月于溪流中繁殖，其余時間陸棲。2只峨眉髭蟾標本于2019年5、6月采自四川省峨眉山，均為非繁殖季節雄性成體，編號為IOZCAS09432(吻肛距=80.6 mm，大個體)、IOZCAS09433(吻肛距=72.2 mm，小個體)。該物種非繁殖季節時活動隱秘，陸棲個體多年來少有獲取，對其陸棲個體皮膚毛細血管豐富度的報道有利于國內外同行據此進行對比分析。氣體交換是蛙類皮膚的重要功能，體型較大的個體因其體表面積/體質量比較小，毛細血管豐富度較高。2只個體體型大小不同，若符合該預期則支持實測結果的可靠性。麻醉采用低于5%乙醇以減小刺激，固定液為8%甲醛，固定后流水置換甲醛24 h再轉70%乙醇長期保存。切片前，每只蛙取頭背部、軀干背部、前肢背側、后肢背側、體側、下頜、胸部、下腹、前肢腹側、后肢腹側10個身體右側部位皮膚，均為5 mm×6 mm長方形。對皮膚組織進行常規石蠟包埋切片，切片厚度6 μm。每塊皮膚盡量獲得約15張載玻片的連續切片，每張載玻片上為3列、每列15條切片。蘇木精-伊紅染色(Preece，1965)，樹膠封片。

編寫R腳本對30個樣本值無放回抽樣，模擬1載玻片×1圖像、1載玻片×2圖像、……、1載玻片×6圖像、2載玻片×1圖像、……、5載玻片×5圖像共29種樣本設計，每種設計1 000次重復。不同設計的樣本大小共16種情況，包括1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、15、16、18、20、24、25。不同載玻片被抽取的皮膚切片/圖像位置相同，以契合常見的等距取樣策略(曹燕等，2011；Brunettietal.，2012；Pratesetal.，2012)。1 000個模擬結果的均值幾等于真實結果。以真實結果的5%為評判閾值，即樣本均值×0.05，若其大于1 000個模擬結果的標準差，則大多數模擬結果和真實結果的相似性高于95%、該模擬設計可靠。以此相似性標準，統計各部位獲得接近真實結果所需樣本量，記錄滿足該標準的3個最小樣本量的中位數。為比較相同樣本量、不同工作量的設計，對“1載玻片×5圖像、5載玻片×1圖像”和“2載玻片×5圖像、5載玻片×2圖像”這2對設計的模擬結果標準差進行配對t檢驗。對毛細血管豐富度和可靠設計數量進行Pearson相關檢驗，以探索前者對所需樣本量的影響。各檢驗在SPSS 11.0中進行，數據處理前用Kolmogorov-Smirnov檢驗確認用于配對t檢驗的變量的差值和用于Pearson檢驗的變量不顯著偏離正態分布(P值均大于0.05)。

2 結果

2只個體表皮下毛細血管豐富度分布模式基本一致。與其理論上較低的體表面積/體質量比值相符，大個體各部位毛細血管豐富度多高于小個體(圖1)。兩者在體側和后肢腹側都有較高密度的毛細血管，為10.5～15.3條/mm；而頭背部是毛細血管密度均較低的部位，分別為4.6條/mm和6.1條/mm。

圖1 2只雄性峨眉髭蟾身體右側10個部位表皮下毛細血管豐富度Fig. 1 Densities of capillaries beneath the epidermis in 10 parts on the right side of 2 male Leptobrachium boringii

和預期相符，模擬結果隨著樣本量的增加趨近實測值(圖2：A)。各部位模擬結果有差異(表1)：體側、下頜、下腹、后肢腹側獲得接近真實結果所需最小樣本量約為8，密度較低的頭背部則需20或25，密度最低的小個體胸部無法獲得接近真實值的模擬結果。大個體所需樣本量更小、可靠樣本設計共95個，小個體為46個；除前肢背側相同外，大個體各部位可靠樣本設計均多于小個體。Pearson相關檢驗表明，2只個體各部位毛細血管豐富度和可靠設計數量均呈顯著正相關(圖2：B，C)，大、小個體相關系數分別為0.855和0.874(P值均小于0.01，n=10)。配對t檢驗顯示，當樣本量固定為5或10時，不同工作量的抽樣設計對結果影響不明顯，模擬結果標準差之間的差異無統計學意義(P值均大于0.1，n=10)。

表1 可靠模擬設計Table 1 Successfully simulated sampling designs

注：*可靠模擬設計數小于3時， 直接列出樣本量

Note：*When there are less than 3 successfully simulated sampling designs， the sample size of each design is listed

3 討論

本研究系統中，對一些部位如頭背部、前肢背側表皮下毛細血管豐富度的量化需要較多的切片。對比大、小個體，各部位表皮下毛細血管相對豐富度分布基本一致，有較小體表面積/體質量比的大個體毛細血管豐富度更高。兩者體側和后肢腹側較高的毛細血管密度與在蛙類中已觀察到的模式相同(Czopek，1965；Toledo & Jared，1993)。無尾兩棲類后肢腹側是皮膚水、氣交換的關鍵部位，毛細血管密度一般較高(Roth，1973；Bentley & Yorio，1979)。這些一致性提示本工作的實測結果可靠?；趯崪y數據的模擬顯示，小個體雄性多數部位需要接近20條組織或更高的樣本量，大個體多數部位需要接近15條或更高的樣本量。對比相同樣本量、不同工作量的取樣設計，基于較大工作量即更多制片的取樣未得到顯著理想的結果。但2對設計的樣本量均較小，分別為5和10，不足以支持較少制片的策略，有待于在更合適的研究系統中探討。一套皮膚石蠟切片可用于不同特征的量化，實際工作中也常如此，制片量不能僅針對需少量樣本即可準確量化的特征。常規石蠟切片實驗周期較長，但更多的展片、染色、封片并不會大幅增加工作量。相反，如果后期發現樣本量不夠、追加取樣則會成倍耗費時間。另外，以毛細血管密度為例，一些特征在兩棲動物皮膚不同部位的分布很不均一(Moallietal.，1980)，追加取樣可能難以對應部位、無法補救。因此，建議在兩棲類皮膚石蠟切片工作中對全部有效切片進行制片，以滿足不同特征對樣本量的要求。

對比不同個體相同部位以及同一個體不同部位，表皮下毛細血管豐富度與所需樣本量呈負相關。這顯示來自高血管豐富度部位的測量值方差更小，這些部位的血管分布可能更均勻。這樣的規律是否在其他兩棲動物中存在、在什么樣的毛細血管豐富度范圍內存在，仍需考查。如有其普遍性，則對實際工作有指導意義。如前所述，同一物種的較小個體一般有更高的皮膚面積/體質量比，故可能有較低的毛細血管密度。兩棲動物皮膚毛細血管豐富度分布有一定規律可循，部分物種的該特征已有量化(Czopek，1965；de Saint-Aubain，1982；Malvin，1988；Toledo & Jared，1993)。某些生活史特征如陸棲、水棲與該特征關聯(耿欣蓮，1959；唐以杰等，1999；Barejetal.，2010)。這些已有信息可否用于抽樣策略的制定，有待在其他兩棲動物類群中進行與本工作類似的相關性分析。需要指出的是，本工作以模擬結果的標準差是否小于實測結果值的5%為判斷依據，該閾值在低豐富度部位顯然更小，但這樣的設定更符合以相似性評判結果穩定性的實踐標準。

圖2 模擬結果示例和毛細血管豐富度對所需樣本量的影響Fig.2 An example of the simulation results and the relationship between capillary densities and sample sizes required

致謝：衷心感謝中國科學院成都生物研究所曾一唯師姐、周星梅老師、曾曉茂老師的幫助與建議。