可手術的非小細胞肺癌患者TUBB3基因mRNA表達與預后相關性

趙云龍，李璟波，趙英男，陳 平，劉 波，劉 陽

肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中85%以上是NSCLC。肺癌死亡率已成為惡性腫瘤的第一位[1,2]。隨著驅動基因的發現，NSCLC治療進入了精準治療時代，最常見的標志物是EGFR、ALK等驅動基因[3]，以分子標志物作為肺癌靶向藥物的指導已成為治療標準。近年來，肺癌中DNA修復基因，如切除修復交叉互補基因1(ERCC1)、微管蛋白β-Ⅲ(TUBB3)、核糖核苷酸還原酶M1(RRM1)等基因也受到關注[4,5]。一方面這些DNA修復基因與化療存在一定的相關性，為肺癌化療藥物的選擇提供了依據。另一方面這些基因也是肺癌重要的預后因子。TUBB3編碼β-Ⅲ型微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ)，是細胞骨架和紡錘體主要成分的微管蛋白，與細胞有絲分裂等相關，是肺癌的預后因子[6]。以往研究報道了TUBB3蛋白表達與NSCLC預后相關，本文主要研究TUBB3 mRNA的表達與NSCLC預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 NSCLC樣本 選擇2012-01至2014-06在解放軍總醫院第四醫學中心手術治療的NSCLC患者石蠟標本92例，其中男52例(56.52%)，女40例(43.48%)。NSCLC的診斷及分期依據肺癌國際TNM分期標準(2009第7版)進行。

1.2 TUBB3 mRNA表達水平檢測方法 采用分支-DNA液相芯技術(又稱bDNA技術)定量檢測石蠟組織的TUBB3 mRNA水平，和傳統的RT-PCR方法相比，檢測過程中無需RNA提取和cDNA反轉錄，也無需PCR，直接定量檢測。對92例石蠟包埋標本進行編號，TUBB3探針包被至45#微球，內參基因B2M、TBP、TFRC的微球號分別是23#、24#、25#，陰性對照15#微球。將編好號的標本取80 mg放入EP管中，加入1 ml裂解液，在56 ℃下充分裂解2～3 h；將樣本裂解液轉移至孵育板上，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，55 ℃震蕩孵育過夜16 h；第二日將含有樣本裂解液的孵育板放在磁力架上1 min，當微球聚集在底部時，吸取上清，棄掉；在管中加入1 ml洗滌液，震蕩洗滌 1 min，將孵育板放在磁力架上1 min，吸取上清，棄掉。該步驟重復洗3 次；加入擴增探針和標記的48#、23#、24#、25#探針，50 ℃震蕩反應1 h。將孵育板放在磁力架上 1 min，吸取上清，棄掉，洗滌液重復洗2次；加入10 μl鏈霉親和素-藻紅蛋白，50 ℃震蕩反應30 min準備上機；按照步驟操作Luminex 200儀器，輸入讀數的參數設置和樣本孔在96 孔板上的位置，按鍵反應。

1.3 隨訪 連續隨訪時間從2013年12月開始，通過住院患者、門診病歷、電話隨訪等方式，隨訪至2018年12月。隨訪時間10～60個月，平均30個月。隨訪截止日期尚生存的患者記為截尾數據。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0軟件進行數據分析，用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組間隨訪時間的比較用Log-rank檢驗，用COX比例風險模型計算RR。計算終點事件發生例數和百分數，并計算相應率的95%可信區間。P<0.05為差異具有統計學意義。采用多元線性回歸、Logistic回歸、Cox模型等方法，評價影響TUBB3 mRNA表達與NSCLC預后相關性。采用乘積極限法、壽命表法或Cox回歸分析進行TUBB3 mRNA不同表達類型患者的生存分析。

2 結 果

2.1 TUBB3 mRNA表達及相關性 92例石蠟包埋組織標本評估合格，采用分支DNA液相芯片定量檢測TUBB3 mRNA的表達，內參基因選擇B2M、TBP、TFRC。按照中國人群數據庫將TUBB3 mRNA表達劃分為低表達和高表達。92例患者中TUBB3 mRNA低表達的患者33例(35.9%)，TUBB3 mRNA高表達的患者59例(64.1%)。通過分析TUBB3 mRNA表達和年齡、性別、組織類型、吸煙史、分期等臨床相關性，結果發現：TUBB3 mRNA在吸煙的患者中表達水平遠高于不吸煙者,差異有統計學意義(P=0.017)。TUBB3 mRNA與腺癌和鱗癌的組織學類型、與分期和分化程度差異均無相關性(P>0.05，表1)。

表1 TUBB3 mRNA表達與臨床特征的相關性 (n；%)

2.2 TUBB3 mRNA表達與NSCLC預后的相關性 分析TUBB3 mRNA表達水平與總生存期(OS)、無疾病進展生存期(PFS)的相關性，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，92例中TUBB3 mRNA低表達的患者中位PFS為35.7個月，高表達的患者中位PFS為23.5個月，HR=1.33，95%CL：1.06～2.32，TUBB3 mRNA低表達的患者中位PFS明顯長于高表達患者，差異有統計學意義(P=0.001，圖1 A)。

TUBB3 mRNA低表達的患者中位OS為48.7個月，HR=1.56，95%CL：1.45-2.56。TUBB3 mRNA高表達的患者中位OS為35.8個月，HR=1.56，95%CL：1.45-2.56。TUBB3 mRNA低表達的患者OS長于高表達患者，差異有統計學意義(P=0.011，圖1B)。

圖1 TUBB3 mRNA高表達與低表達患者的OS和PFS

3 討 論

組成微管的蛋白有α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，其中β微管蛋白與細胞有絲分裂、細胞器組成及運輸等有關。TUBB3是DNA修復類基因，化療藥物紫杉醇/多西他賽通過作用該靶點來抑制紡錘體微管形成，進而干擾細胞各種功能，最終達到治療的目的。因此TUBB3的表達可能會影響抗微管類藥物的療效，已成為臨床上研究的熱點[7-9]。

本研究采用分支-DNA液相芯片方法對92例NSCLC患者的TUBB3mRNA表達進行檢測，結果顯示，TUBB3 mRNA的表達和吸煙史有一定的相關性，吸煙的患者更容易出現TUBB3的高表達，這和文獻[9]報道的結果一致。Levallet等[10]發現，TUBB3表達和病理分期有一定的相關性，和鱗癌相比，腺癌患者中TUBB3表達陽性的患者更多(70vs218)。Reiman等[11]發現，TUBB3表達陽性的較多。這些研究主要采用免疫組化的方法檢測TUBB3的蛋白水平[12，13]。由于免疫組化的方法靈敏度不夠，受不同類型的抗體影響，結果不夠穩定，導致目前文獻報道的結果不一致。本研究從mRNA水平研究TUBB3的表達，采用中國人群的數據庫劃分表達的高低。但本研究發現TUBB3表達和分期、病理類型沒有相關性，這和部分文獻報道不一致。可能是mRNA水平和蛋白水平存在一定差異，也與本研究的病例較少有關，還需要進一步的研究證實。

Gong等[14]采用免疫組化的方法研究TUBB3表達和NSCLC的預后相關性，結果顯示TUBB3陰性患者有更長的OS和PFS。Levallet等[10]發現，TUBB3陰性的患者OS更長(84.0個月vs71.7個月，HR=1.58; 95%CI：1.11～2.25)。本研究發現，TUBB3 mRNA低表達與高表達的患者中位總生存期差異有統計學意義，TUBB3 mRNA低表達的患者有更長的中位OS，這和文獻[10]報道基本一致。Zhang等[15]發現，TUBB3高表達的手術切除后NSCLC患者可從含長春瑞濱輔助化療中顯著獲益，其無病生存期顯著延長(P=0.031)，而OS差異無統計學意義(P=0.226)。本研究發現，TUBB3 mRNA低表達的患者有更長的PFS，差異有統計學意義，對臨床有一定指導意義。

綜上所述，本研究結果表明TUBB3 mRNA是NSCLC的獨立預后因子，高表達TUBB3 的OS和PFS更短，預后較差。本研究采用中國人群數據庫從mRNA水平上對TUBB3基因表達進行了分析，首次分析了mRNA水平與可手術的NSCLC的OS和PFS的相關性。下一步，將繼續進行分析TUBB3 mRNA表達水平與化療療效的相關性的研究，進一步探討TUBB3 mRNA與預后相關性的分子機制，為精準治療及判斷預后提供參考依據。