云南省漢族人群LMP基因多態性與結核病易感性的關聯性研究*

劉楠楠， 劉舒媛， 王輝， 張新文， 李傳印， 史荔， 張淑瓊**

(1.中國醫學科學院 & 北京協和醫學院 醫學生物學研究所 & 云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室， 云南 昆明 650118； 2.昆明市第三人民醫院， 云南 昆明 650118)

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌引起的感染性疾病，是危害人類健康的主要傳染病之一[1]。據WHO《2019年全球結核報告》顯示，TB的患病率和死亡率一直高居不下。目前全球約有25%的人口感染了結核分枝桿菌，但只有5%～10%的感染者會發展成為有臨床癥狀的TB患者，表明TB的發生還與個體的遺傳因素相關[2-3]，研究發現宿主遺傳因素對TB的發生發展具有重要的作用。低相對分子量蛋白酶體(low molecular weight proteasome，LMP)又稱為β蛋白酶體亞單位(proteasome subunit beta，PSMB)，位于6號染色體MHC-Ⅱ類基因座區域，由LMP2(PSMB9)和LMP7(PSMB8)組成[4]。LMP2和LMP7是蛋白酶體β亞基家族的成員，編碼蛋白酶體復合物的催化亞基，參與內源性或外源性抗原的降解[5]。LMP可將抗原水解為合適的肽段，水解后的肽段經抗原相關轉運體(TAP)轉運后與MHCⅠ類分子連接，表達于細胞表面供CD8+T細胞識別[6]。因此LMP基因位點的突變可能會導致LMP基因表達異常從而影響自身免疫應答。目前已有多項研究發現LMP基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與感染性疾病[7-8]、自身免疫性疾病[9]和癌癥[10-13]相關。本研究選取LMP2基因的3個SNP位點rs1351383、rs17587、rs2127675和LMP7基因的1個SNP位點rs2071543，并分析LMP基因多態性與云南漢族人群TB病的相關性，報告如下。

1 資料與方法

1.1 樣本收集

根據知情同意原則，選取2018-2019年在昆明市第三人民醫院就診并確診為TB的449例患者作為病例組。病例組的納入標準：(1)國家肺TB診斷標準(WS288-2017)標準，根據患者的臨床表現、結核抗酸染色和影像學檢查確診為TB；(2)無合并感染或其他疾病；(3)臨床資料完整。根據我國TB分類標準(WS196-2017)將病例組再分為肺結核組和肺外結核組，肺TB指病變發生在肺、氣管、支氣管或胸膜等部位，肺外TB指病變發生在肺以外的部位；根據治療史，將病例組再分為初治組和復治組。選取同期參加體檢的367例健康人群作為對照組。對照組的納入標準：(1)經痰涂片結核抗酸檢查為陰性的個體；(2)既往無TB史；(3)無其他疾病；(4)臨床資料完整。所有受試者均為居住于云南地區的無親緣關系的漢族個體。

1.2 方法

1.2.1樣本DNA提取 采集研究對象靜脈血5 mL(EDTA抗凝)，使用全血基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國QIAGEN公司，貨號 51106)提取外周血基因組DNA，超微量紫外可見分光光度計 (Multiskan GO，美國ThermoFisher Scientific公司)檢測DNA的濃度及純度后于-20 ℃保存備用。

1.2.2LMP基因SNPs位點的選擇 結合文獻報道和Ensemble數據庫(http://asia.ensembl.org/index.html)查詢，納入在東亞洲人群中最低等位基因頻率>0.1的位點進行研究。

1.2.3LMP基因SNP檢測 設計SNP位點特異性的擴增引物和延伸引物，擴增引物和延伸引物信息見表1。擴增體系為模板DNA (25 ng)、上下游引物(10 μmol/L)各2 μL、TSINGKE金牌Mix 45 μL，總反應體系50 μL。PCR擴增反應條件：98 ℃預變性 2 min，98 ℃變性10 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s(共30個循環)。PCR產物經SAP消化(37 ℃ 1 h、75 ℃ 15 min)后進行單鏈延伸，延伸體系：SAP消化后模板 2 μL、ABI SnapShot multiplex Mix 2 μL、SNP對應引物1 μL；延伸反應條件：98 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(25個循環)。經測序儀(Applied Biosystems，3730XL)檢測后通過峰的移動位置確定該延伸產物對應的SNP位點，根據峰的顏色可得知滲入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。LMP2和LMP7基因的擴增引物和延伸引物信息見表1。

表1 LMP2和LMP7基因的引物序列Tab.1 Primer sequences for LMP2 and LMP7 genes

1.3 統計學方法

使用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，分別采用t檢驗和χ2檢驗對病例組和對照組中的年齡和性別的分布進行比較，哈迪-溫伯格平衡用goodness-of-fitχ2檢驗進行計算。病例組和對照組間各SNP的等位基因、基因型頻率差異用χ2檢驗進行比較。使用SHEsis[14]在線軟件計算各SNP位點間的連鎖不平衡，根據連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)結果構建單倍型，兩位點間的LD關系用D′表示，D′>0.8認為位點間強連鎖。病例組和對照組間的單倍型分布差異用χ2檢驗進行比較。采用SNPStats[15]在線軟件對LMP基因的SNP位點進行遺傳模式分析，根據赤池信息量準則(akaike information criterion,AIC)和貝葉斯信息準則(bayesian information criterions,BIC)的數值來確定每個位點的最優遺傳模式，即具有AIC、BIC最小值的遺傳模式。用于分析的遺傳模式共包括5種：共顯性遺傳模式(codominant model)、顯性遺傳模式(dominant model)、隱性遺傳模式(recessive model)、超顯性遺傳模式(overdominant model)及加性遺傳模式(log-additive model)。統計學結果當P<0.05時具有統計學意義；多重比較的統計學結果使用Bonferroni校正，設定P<0.05/n(n=4)具有統計學意義。

2 結果

2.1 病例及對照組基本信息

本研究病例組共納入TB患者449例，對照組納入健康對照367例，病例組與對照組的性別和年齡比較差異無統計學意義(P=0.095、0.340)。納入研究對象的基本特征見表2。

2.2 納入研究的位點及Hardy-Weinberg平衡檢驗

本研究納入LMP2基因的3個SNP位點rs1351383(A>C)、rs17587(G>A)、rs2127675(A>G)和LMP7基因1個SNP位點rs2071543(G>T)；各SNPs位點信息見表3。4個SNP的基因型在病例組(P=0.843、0.394、0.864和0.827)和對照組(P=0.433、0.531、0.994和0.941)中的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡檢驗(P>0.05)，說明本研究所選取的樣本是具有群體代表性的隨機樣本。

表2 研究對象基本特征Tab.2 Basic characteristics of the subjects

表3 LMP基因4個SNPs的位點信息Tab.3 The information of 4 SNPs of LMP gene

2.3 等位基因和基因型頻率

結果顯示，4個SNP位點的等位基因和基因型頻率在病例組與對照組間比較，差異經Bonferroni校正后均無統計學意義(P>0.012 5)。見表4。

2.4 遺傳模式分析

共顯性遺傳模式、顯性遺傳模式、隱性遺傳模式、超顯性遺傳模式和加性遺傳模式分析結果顯示：4個SNP位點在其最優遺傳模式下差異均無統計學意義(P>0.0125)。見表5。

2.5 LMP基因4個SNP構建的單倍型分析

對LMP基因的4個SNP位點進行連鎖不平衡分析，結果顯示4個位點間存在強連鎖(D′>0.8)，構建rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543單倍型并分析頻率>3%的單倍型在病例組和對照組中的分布差異，單倍型C-G-G-G在病例組中的頻率顯著高于對照組(P=0.004，OR=1.671，95%CI為1.176～2.372)。見表6。

表4 病例組和對照組LMP基因的4個SNP位點的等位基因和基因型頻率比較Tab.4 The frequencies of alleles and genotypes of 4 SNPs of LMP gene in TB group and control group

注：經Bonferroni校正后，當P<0.012 5時差異具有統計學意義。

表5 病例組和對照組中4個SNP位點的遺傳模式分析Tab.5 Analysis of inheritance models of 4 SNPs in TB group and control group

注：加性遺傳模式表示TT×2+GT的基因型與GG基因型進行比較(多態性位點如為G>T的變異)，經Bonferroni校正后，設置P<0.012 5有統計學意義。

表6 病例組和對照組 LMP基因4個SNP位點單倍型頻率比較Tab.6 Comparison of haplotypic frequency of 4 SNPs of LMP gene in TB group and control group

注：經Bonferroni校正后，當P<0.01有統計學意義。

2.6 分層分析

將病例組又分為肺結核組、肺外結核組、初治組和復治組進行分層分析。運用邏輯回歸模型校正性別和年齡差異后結果顯示：rs1351383的C等位基因在肺外結核組的頻率顯著高于對照組，2組間等位基因頻率分布具有統計學意義(P=0.010，OR=1.377, 95%CI為 1.030～1.841)；在最優遺傳模式——加性遺傳模式下，rs1351383的基因型分布差異具有統計學意義(P=0.008，OR=1.520，95%CI為1.120～2.080)。復治組與對照組、復治組與初治組的4個SNP等位基因和基因型頻率差異均無統計學意義(P>0.05)，見表7。構建LMP2基因的單倍型分析結果顯示：rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543單倍型C-G-G-G在肺外結核組中的頻率(0.131)顯著高于對照組中的頻率(0.070)(P=0.003，OR=1.982，95%CI為1.246～3.154)，經Bonferroni校正后，差異具有統計學意義(P<0.01)。

表7 肺外結核組和對照組中rs1351383的等位基因、基因型頻率比較Tab.7 The frequencies of alleles and genotypes of rs1351383 in EPTB group and control group

注：經Bonferroni校正后，當P<0.0125有統計學意義。

3 討論

LMP是1982年Monaco在分析鼠MHC-Ⅱ類分子的免疫沉淀復合物時得到的產物，因其分子量較MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子低而得名[16]?；蚯贸∈髮嶒炞C明了LMP2和LMP7的作用，在LMP2基因突變小鼠的CD8+T淋巴細胞水平降低至野生型小鼠的60%～70%[17]；在LMP7基因敲除小鼠中，細胞表面MHC Ⅰ類分子的表達水平適度降低至正常水平的55%～90%[18]。這些結果均表明LMP在抗原提呈過程中起著重要作用，LMP可以識別細胞內感染，降解內源性抗原肽，產生合適的C-端氨基酸殘基[5]，并通過MHC Ⅰ類分子和細胞毒性T淋巴細胞在人體免疫監測中發揮關鍵作用，因此LMP基因多態性可能會影響其自身功能的完整性，從而影響抗原的加工提呈，最終導致疾病的發生[19]。

有研究發現LMP基因多態性與TB的發生發展具有關聯性，因此，本研究對LMP基因4個SNP位點的多態性與云南漢族人群TB病的發生發展的相關性進行研究，結果發現4個SNP位點的等位基因及基因型頻率在病例組和對照組中的差異均無統計學意義，進行分層分析時發現，rs1351383的C等位基因頻率在肺外結核組中的頻率顯著高于對照組，在加性遺傳模式下攜帶rs1351383的C等位基因的有增加患肺外TB發生風險的趨勢。進一步的單倍型分析顯示rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543單倍型C-G-G-G在病例組、肺外結核組中的頻率均顯著高于對照組。有研究報道，rs1351383的CC基因型顯著增加了黑色素瘤的患病風險(CC vs AA：P=1.93×10-3,OR=1.590,95%CI為1.190～2.120)，rs1351383可能參與并影響轉錄因子的結合和LMP2基因的表達，從而影響黑色素瘤的易感性[20]。Wang等[21]在黎族人群肺TB的研究顯示：rs2071543的AA(P=0.002，OR=3.770，95%CI為1.600～8.890)和AC(P=0.0001，OR=2.970，95%CI為1.800～4.900)是肺TB發生的風險性因素。在rs2071543與癌癥風險相關性的薈萃分析中發現AA基因型的個體比具有CC基因型的個體患癌癥的風險高2.6倍(AA vs CC：P= 0.001，OR= 2.602，95%CI為 1.780～0.803)，并在亞洲人群中觀察到罹患癌癥風險顯著增加，但在白種人群中未發現rs2071543與癌癥的相關性[13]。rs17587的多態性可影響LMP2基因的功能也在青少年高血壓、多發性硬化癥、糖尿病和結核桿菌感染的研究中均有報道[20]。LMP在抗原提呈過程中發揮著重要作用，LMP基因突變將導致MHCⅠ類分子不能負載抗原肽，使MHC I類分子表達下調[4]。已知LMP2基因rs17587和LMP7基因rs2071543是錯義突變位點，研究表明rs17587和rs2071543的多態性會導致LMP的功能改變，從而削弱抗原加工能力，使細胞表面MHC I類分子和細胞毒性T淋巴細胞的表達水平降低，影響自身免疫應答導致機體免疫監測失敗進而影響機體對疾病的易感性[12,19]，因此LMP的異常表達會導致多種疾病和惡性腫瘤的發生。但本研究中未發現rs17587和rs2071543的基因型與TB病相關。造成上述各研究結果差異的原因可能是多態性位點的等位基因頻率在不同人群中的分布差異所導致，也可能與納入研究的樣本量或疾病類型有關。

綜上所述，云南漢族人群中LMP2基因的rs1351383-C等位基因及其構建的單倍型rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543單倍型C-G-G-G可能增加肺外TB的患病風險。進一步擴大樣本量研究及功能驗證，將為TB病的治療及預后提供新的依據。