基于小孢子培養的芥藍單倍體育種技術研究

羅文龍，郭巨先，符 梅，李桂花，徐小萬，劉洪標，田永紅

（廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室/廣東省農業科學院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】芥藍（Brassica oleraceavar.alboglabra）為十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，以花薹為主要食用部分，風味獨特，是華南地區的特色蔬菜品種[1]。芥藍純系（即自交系）的創制，是進一步選育芥藍常規種、雜交種的基礎和前提。傳統的純系生產方法，主要依賴于雜交后的連續自交純化，一般需自交6～8個世代。然而，芥藍是喜涼蔬菜作物，在華南地區只有冬春季能正常開花結實，使其自交系的選育周期漫長、育種效率低下。因此，芥藍育種發展較慢，品種數量較少、類型較單一[2]，已經越來越難以滿足生產需求。利用組織培養或誘導系誘發單倍體，再通過染色體加倍產生純合度為100%的雙單倍體（Doubled Haploid, DH），是一種快速創制純系（即DH系）的途徑。在此基礎上發展形成的單倍體育種技術，只需2～3個世代即可創制自交系，能大幅縮短育種周期、提高育種效率[3-4]。更為重要的是，單倍體育種技術的成熟發展，為作物基因組選擇育種提供了重要支撐[5]。【前人研究進展】目前，單倍體育種已在跨國種子企業玉米、小麥和油菜等大田作物的育種中得到大規模應用[6-7]。在甘藍、花椰菜、大白菜、蘿卜等蔬菜作物，基于小孢子培養的單倍體育種技術也得到較多應用[8-11]。隨著單倍體育種理論和應用基礎研究的發展，可以預見，單倍體育種將成為未來最重要的育種關鍵技術之一。單倍體育種的技術流程，主要包括誘導產生單倍體、染色體加倍以及加倍植株的自交成系。單倍體育種流程相對較復雜，需要對各技術環節不斷優化，加以改進。單倍體育種流程的建立和優化，對于縮短芥藍育種周期、提高育種效率有重要意義。【本研究切入點】我們前期已對芥藍小孢子培養技術開展了初步研究[12]，發現胚狀體的誘導率與材料基因型密切相關。在此基礎上對芥藍單倍體育種的技術流程進行整合和優化。【擬解決的關鍵問題】建立一套較完整有效的芥藍單倍體育種技術流程，探討芥藍DH系的規模化生產和育種應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用Lb07M、612M、孤老種等14份不同類型的芥藍材料（表1）開展小孢子培養。上述材料于2017年秋季播種于廣東省農業科學院蔬菜研究所白云基地，按常規方法管理，至2017年12月中旬（盛花期）采集花蕾進行試驗。

游離小孢子的采集和培養，使用B5液體培養基和NLN液體培養基；胚狀體和小苗的培養，使用培養基B5固體培養基、MS和1/2 MS固體培養基。上述培養基均為公開配方，為方便使用，直接購買商業的預配培養基粉末，按廠家推薦方法進行配制和滅菌處理。其中，B5液體培養基和NLN液體培養基添加13%蔗糖，B5固體培養基、MS和1/2 MS固體培養基添加3%的蔗糖，pH均調整至 5.8～5.9。

用于染色體加倍處理的秋水仙素溶液，質量體積濃度為0.1%，溶劑為磷酸鹽緩存溶液（pH7.0），同時含2%二甲基亞砜（DMSO）。

1.2 試驗方法

1.2.1 研缽研磨提取芥藍小孢子 選擇處于盛花期的供體植株，于晴天上午采集花蕾。挑取適期（單核靠邊期）花蕾40個，置于研缽，用75%乙醇消毒30 s，再用8%次氯酸鈉滅菌15 min，最后用無菌蒸餾水沖洗3次。于研缽中加入5 mL的B5液體培養基，用研棒輕輕擠壓花蕾使小孢子從花藥中游離，然后將含游離小孢子的液體培養基倒入過濾器（網格大小為40 μm）過濾，濾液盛入50 mL離心管；重復2次，以盡可能多獲得游離小孢子。

表1 供試14份芥藍材料Table 1 Fourteen Chinese kale accessions used for the trial

裝有游離小孢子的離心管以1 000 r/min離心3 min，棄上清；再加入10 mLNLN液體培養基離心洗滌2次（1 000 r/min，3 min），棄上清。向離心管加入NLN液體培養基溶解小孢子，調節濃度，分裝于直徑60 mm培養皿（每皿約5 mL），用封口膜密封，做好標記。

1.2.2 離心管機械破碎提取芥藍小孢子 在挑取用于手工研磨芥藍花蕾的同時，從相同材料中挑取適期花蕾，用于機械破碎提取小孢子。將40個花蕾放入2 mL離心管，用75%乙醇消毒30 s，再用8%次氯酸鈉滅菌15 min，最后用無菌蒸餾水沖洗3次。消毒和沖洗后的液體均用移液器盡可能地吸去。離心管內放入直徑4 mm的滅菌鋼珠，加入1 mL B5液體培養基；離心管蓋好，放入FastPrep-24快速核酸提取儀（MP，美國），以4.0 m/s的振蕩速度振蕩20 s；將含游離小孢子的液體培養基倒入過濾器過濾，濾液盛入50 mL離心管，取適量B5液體培養基沖洗離心管2次，倒入過濾器。

裝有游離小孢子的離心管以1 000 r/min離心3 min，棄上清；再加入10 mL NLN液體培養基離心洗滌2次（1 000 r/min，3 min），棄上清。獲得的游離小孢子，加入NLN液體培養基調節濃度，分裝于直徑60 mm培養皿中（每皿約5 mL），用封口膜密封，做好標記。一般40個芥藍花蕾提取的游離小孢子，調節濃度后可分裝5個培養皿。

1.2.3 芥藍游離小孢子的培養 將封口的培養皿先于32.5℃暗培養24 h，再轉至25℃繼續暗培養，一般2～3周出現胚狀體；將胚狀體移入B5固體培養基光照培養（20℃，14 h光/10 h暗，光強2 000 lx），15 d更換一次培養基進行繼代培養；待形成子葉型、魚雷型胚后，轉移至MS培養基培養（20℃，14 h光/10 h暗，光強2 000 lx），誘導成苗，15 d更換一次培養基進行繼代培養；經3～4次繼代培養后，每個株系將不少于5個再生苗轉移至1/2 MS固體培養基上進行生根培養，約2周后獲得生長健壯的再生植株。

1.2.4 芥藍單倍體的染色體加倍 將再生植株移至壯苗環境下（24℃，16 h光/8 h暗，光強2 000 lx）生長3～4 d后，用0.1%秋水仙素溶液浸根10 h進行加倍處理，再用自來水沖洗3～4 h，然后移栽至壯苗生長環境下緩苗2～3周。緩苗處理后，與其他未經秋水仙素處理的幼苗同時移栽至人工氣候室，控制光照和溫度，使其緩慢生長；待天氣轉涼（2018年9月）移栽至田間，在蕾期進行單株自交留種。

1.2.5 芥藍再生苗染色體的細胞倍性鑒定 通過分析DNA含量，對芥藍小孢子培養的再生苗進行染色體倍性鑒定。DNA含量測定利用流式細胞儀（Partec CyFlow PA，美國）完成，具體方法如下：取大小為0.5 cm×0.5 cm的鮮嫩葉片置于6 cm玻璃培養皿中，滴加400 μL核裂解液（Cystain UV precise P，Sysmex）浸沒樣品；用鋒利刀片切割葉片，盡量使每刀都徹底切斷，直至成為較小的葉片（注意不要成糊狀）；滴加1 600 μL核染色液（Cystain UV precise P，Sysmex）染色，然后在30 μm濾網過濾，上機測定染色體含量。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取芥藍小孢子誘導胚胎形成效果

前期研究中，發現芥藍小孢子培養誘導胚胎形成的頻率與基因型密切相關，通過篩選后只有部分材料能夠有效誘導出胚狀體。本研究利用經篩選過的5個純系及其配制的雜交一代，以及2個已通過品種審定的雜交一代（冬盛芥藍、冬綠芥藍）共14份材料（表1），開展小孢子培養研究，并就不同方法提取小孢子誘導形成胚胎效果進行對比。結果（表2）表明，離心管機械破碎提取的芥藍小孢子，平均胚狀體誘導率為11.96%，略高于手工研磨的10.80%，但差異不顯著。通過機械研磨，污染率低于研缽研磨，可能是導致其胚狀體誘導率稍高于研缽研磨的主要原因。可見，機械破碎能夠替代手工研磨來批量地處理樣品，從而提高芥藍小孢子的提取效率。

2.2 芥藍再生苗的產生及倍性分析

芥藍小孢子培養產生的胚狀體，經繼代培養后誘導形成再生苗（擬單倍體），再生苗又經歷多次繼代培養（圖1A），最后經過生根培養（圖1B），至第2年6月共得到112個芥藍再生株系（每個株系不少于5株）。從誘導產生芥藍胚狀體，到最終形成完整再生植株，整個過程都可能發生染色體的加倍。在獲得的芥藍再生苗株系中，隨機選50個單株，取其葉片進行染色體DNA含量測定，發現大多數為單倍體（圖1C），僅有6個為二倍體（圖1D）。推測通過小孢子培養得到的芥藍再生苗大多數為單倍體。

2.3 芥藍再生植株的田間表現

芥藍小孢子培養獲得的再生植株（擬單倍體），需經過染色體加倍，才有可能產生正常的花器官和配子，進而自交產生種子，形成DH系。從獲得的112個芥藍再生苗株系，取62個株系進行秋水仙素處理，再與其他未經處理的株系，一起移植至小盆，置于人工氣候室下使其緩慢生長，至9月初移栽到田間。移栽后，持續觀察芥藍植株長勢；在開花期，對花器官進行觀察，對有花粉的植株進行人工自交。不同芥藍材料產生的再生株系，秋水仙素處理或清水處理數量，及其獲得DH系的數量如表3所示。

表2 不同方法采集芥藍小孢子的培養效果Table 2 Culture results of Chinese kale microspores isolated with different methods

圖1 芥藍小孢子培養再生苗及其染色體DNA含量Fig.1 Regenerated plantlets of microspore culture-based Chinese kale and determination of DNA content of chromosome

田間觀察發現，未經秋水仙素處理的芥藍再生植株，移栽后絕大多數生長緩慢而瘦小，部分提早衰亡，約一半植株能存活并開花，但植株普遍較細小，只有少數株系能產生花蕾（圖2A）。反觀經過秋水仙素處理的芥藍植株，移栽后長勢更好，大多數單株存活至開花，而且在多數株系中出現明顯變大的植株（圖2 B、C）。對芥藍再生植株的花器官進行觀察，發現存在多種不同類型的花（圖2D）。其中，未經秋水仙素處理的株系，花普遍很小且花藥發育異常，表現為典型的單倍體（圖2D第1朵花）；經秋水仙素處理的株系，從花的大小、花瓣和花藥數量等來看，其種類多樣，但單倍體花的比例明顯更少，與二倍體對照類似的花（圖2D第3朵花）明顯增多。此外，秋水仙素處理的芥藍再生植株，相對更容易發現嵌合體，即不同部位葉片和花大小明顯不同植株。上述結果說明，秋水仙素處理提高了芥藍再生植株的存活率和形成嵌合體的頻率。

2.4 芥藍再生植株的自交成系和DH系表型觀察

種植的芥藍再生植株，在蕾期進行人工授粉自交，果莢黃熟時收獲種子。由于芥藍單倍體或多倍體花蕾一般不育或育性很差，很難自交產生種子，因而自交產生的種子幾乎都是DH。最終，112個芥藍再生株系中，共有41個株系獲得不低于10粒的自交種子，即形成41個芥藍DH系，其來源如表3所示。以芥藍DH系與再生株系數量之比計算DH成系率，總的DH成系率為36.61%。其中，經秋水仙素處理的62個株系，共獲得35個DH系，DH成系率為56.45%；而未經秋水仙素處理的50個株系僅獲得6個DH系，DH成系率為12.00%。可見，秋水仙素處理株系的DH成系率是未經處理株系的4.70倍。由DH成系率可知，秋水仙素處理使芥藍單倍體植株的染色體加倍頻率得到大幅增加。

獲得的41個芥藍DH系，在第2年秋季按株系種植，部分株系的植株表現如圖3所示。大田觀察發現，這些芥藍株系內單株之間的表現高度一致，不存在表型分離，說明全部均為DH系。由芥藍純系材料小孢子培養獲得的DH系，植株表型與小孢子供體親本完全相同；而芥藍雜交一代產生的DH系，植株表型出現分離，大多介于雙親之間。這些芥藍DH系部分為自交不親和，后續將從中選擇表現較好的DH系，相互雜交或與其他自交不親和系雜交配制雜交一代，以選育芥藍雜交新品種。

表3 不同芥藍再生株系處理及獲得的DH數量Table 3 Treatment of regeneration lines derived from different Chinese kale and DH lines obtained

圖2 芥藍再生植株的田間表現和花器官比較Fig.2 Comparison of field performance of Chinese kale regenerated plants and their flowers

圖3 部分芥藍DH系植株的田間表現Fig.3 Field performance of partial Chinese kale DH lines

3 討論

利用組織培養或誘導系誘發單倍體進而快速創制純系，是跨國種子企業的主流育種技術之一[7]。利用單倍體育種，只需2～3個世代即可創制純系，能夠大幅縮短育種周期，提高育種效率[13]。本研究利用14個不同類型的芥藍供體材料，開展小孢子培養、染色體加倍和自交收獲，最終產生了41個DH系。從供體材料種植到最終獲得DH系，共經歷3年3個世代（2017—2019年），較以往的自交系選育周期（8～10個世代）大幅縮短，且單株完全一致性、純度更高。

相對傳統自交系選育，單倍體育種的流程較為復雜，流程的不斷優化，對提高DH系選育效率有重要意義。前期研究中，不同研究者對芥藍小孢子培養開展研究，主要集中在基因型、培養基和花蕾預處理對小孢子胚發生的影響，而對于如何優化流程、提高獲得DH系的效率鮮有提及[12,14-16]。在此基礎上，本研究進一步對芥藍單倍體育種體系的流程進行梳理、整合和優化。通過比較機械破碎和手工研磨提取小孢子，我們發現兩種提取方式獲得的胚狀體誘導率無顯著差異，與前人報道結果一致[17]。此外，機械破碎的胚狀體誘導率為11.96%，比手工研磨的（10.80%）稍微更高，推測其原因可能是機械破碎提取小孢子的過程中，與空氣接觸機會更少，因而被污染的機會相對比手工研磨要少。可見，通過離心管機械破碎提取小孢子，較易于實現批量操作，更適合于大規模開展小孢子培養的需要。

理論上，除了在小孢子培養早期的單細胞階段，從胚狀體到再生植株的多細胞階段，可能只有部分細胞發生染色體加倍，從而產生嵌合體。因而可以推測，再生植株尤其是經過秋水仙素加倍處理后的再生植株，有很大一部分是嵌合體。在十字花科蔬菜上，一些研究者通過觀察表型分析二倍體和多倍體植株的頻率，證實秋水仙素處理能有效提高小孢子培養再生植株的染色體加倍頻率[10,18-20]。本研究中，相對未加倍的（擬）單倍體植株，加倍后的植株往往更高大；但二倍體和多倍體植株往往不易區分，更多表現為嵌合體。因此，我們通過對自交后的種子，即DH成系率來進行分析，發現秋水仙素處理后DH成系率是未處理的4.07倍。由此說明，秋水仙素處理的確能夠有效提高芥藍擬單倍體的染色體加倍頻率。另一方面，我們通過DH成系率來衡量染色體的加倍情況，更符合育種實踐，也相對更具有操作性。

在實踐中，DH成系并能成功繁殖，需要有一定數量的DH種子（如10粒以上）；而要獲得足夠的DH種子，就必須有較多的再生植株為基礎（如5株以上）。本研究中，小孢子培養獲得胚狀體255個，經過多次繼代培養和生根等組織培養操作環節，最終形成112個再生苗株系（每株系不少于5株）。可見，只有43.92%的胚狀體能產生再生苗株系；結合秋水仙素處理后DH成系率（56.45%），從產生胚狀到DH成系的頻率為24.79%，即約1/4的胚狀體能形成DH系。按當前的流程綜合分析，我們認為在開展芥藍單倍體育種實踐中，要獲得一個DH系，需要獲得4個以上的胚狀體，按10%的胚狀體誘導率大致計算，需要提取40朵花蕾的小孢子進行培養。此外，由于擬單倍體發育不良，獲得胚狀體之后的多次組織培養操作，有不少再生苗會死亡，有必要開展進一步研究，將秋水仙素處理提早至胚狀體時期或再生苗早期階段。

4 結論

本研究結果表明，機械破碎提取的芥藍小孢子，胚狀體誘導率與研缽研磨提取的無明顯差異，可用于批量處理樣品、提高小孢子提取效率；秋水仙素處理提高了芥藍再生植株在田間的存活率和染色體加倍頻率；獲得了41個芥藍DH系，其中秋水仙素處理再生株系的DH成系率為56.45%，是未處理的4.07倍。通過對小孢子提取方法、再生植株處理及其他環節進行優化，本研究建立了一套較為有效的芥藍單倍體育種技術體系，可在芥藍育種實踐中有推廣應用，提高芥藍育種效率。