大鯢肌肉ACE抑制肽的制備及其穩(wěn)定性

王澤奇，楊雙盼，冉旭*

四川大學(xué)食品工程系（成都 610065）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）可將無(wú)活性的血管緊張素Ⅰ（Ang Ⅰ）催化成血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ），Ang Ⅱ會(huì)促使平滑肌收縮、醛固酮的分泌，導(dǎo)致血壓升高。ACE能通過降解紓緩激肽阻斷血壓下降通路，ACE抑制劑（ACEI）通過抑制ACE活性，降低Ang Ⅱ生成。因而抑制ACE活性可起到調(diào)節(jié)血管舒張功能。

通過蛋白酶將蛋白質(zhì)切割成多肽是制備天然ACEI的主要手段，由于蛋白酶的酶切位點(diǎn)和原料氨基酸組成不同，有超過70種具有ACE抑制作用的多肽被發(fā)現(xiàn)，它們來(lái)自各種不同的食物原料。如Li等[1]從蠶蛹中得到氨基酸組成序列為Val-Glu-Ile-Ser的多肽，其IC50為28.3 μg/mL；Otte等[2]通過酶解、凝膠色譜、反相高效液相色譜等手段從羊奶發(fā)酵制品中得到物種ACE抑制肽，其IC50從1～5 μmol不等。周明等[3]從玉米黃粉中制備得到ACE抑制肽，并利用質(zhì)譜鑒定得到4個(gè)多肽序列，說(shuō)明從天然食物中獲取具有降壓功能的產(chǎn)品的可行性。但這些研究大多使用單酶，而尚未有以大鯢為原料制備ACE抑制肽的報(bào)道，因此，通過單因素及混料試驗(yàn)，優(yōu)化復(fù)合酶法制備大鯢肌肉ACE抑制肽方法，并探究金屬離子和體外模擬胃腸消化道酶系對(duì)ACE抑制率穩(wěn)定性的影響，為大鯢綜合化利用提供理論依據(jù)，為高血壓的輔助治療提供安全有效的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人工養(yǎng)殖大鯢（四川溪源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司）；風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶；N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）（上海底化生物有限公司）；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；濃鹽酸、異硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈（色譜純）、醋酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯化鋁、氯化鐵、氯化鋅等（成都市蜀都牛牛生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國(guó)）有限公司）；HH4恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；TGL-15B告訴臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電動(dòng)攪拌機(jī)器（方科儀器有限公司）；JA1023型電子天平（上海精科天平廠）；Spestra Max 90光吸收酶標(biāo)儀（美谷分子儀器上海有限公司）；LGJ-30F冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大鯢肌肉多肽制備工藝流程

參考胡廷等[4]的方法并略作修改。將冷凍的大鯢室溫解凍，切除爪、脂肪、皮、骨等部位。將肌肉切成肉泥，加入設(shè)定液料比的蒸餾水。放入恒溫水浴鍋保持設(shè)定水溫。加入酶。輔以電動(dòng)攪拌機(jī)進(jìn)行酶解。酶解完成后，煮沸10 min以滅酶。待其冷卻至室溫，以4 000 r/min離心15 min，常壓煮沸濃縮至固形物含量10%左右，將上清液通過真空冷凍干燥50 h即得到大鯢肌肉多肽粉，保存于干燥器中。

1.3.2 大鯢肌肉氨基酸測(cè)定

取1.0 g左右質(zhì)量的樣品于20 mL水解管中，加入8 mL 6 mol/L鹽酸溶液，真空脫氣30 min，充氮封管，在110℃下水解24 h，取出冷卻開管，用去離子水無(wú)損轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，并定容。準(zhǔn)確取1 mL水解液于小瓶中，于真空中脫酸抽干，加1 mL水抽干，加1 mL水再抽干備用。準(zhǔn)確加入10 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液，充分溶解，準(zhǔn)確量取上述溶液500 μL，置于5 mL塑料離心管中，精密加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250 μL，混勻，準(zhǔn)確加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液250 μL，混勻，室溫放置1 h，加2 mL正己烷，劇烈振搖，放置10 min，取下層溶液用0.45 μm的濾膜過濾上機(jī)分析。

1.3.3 蛋白酶初篩

考慮到酶解條件的簡(jiǎn)便性和復(fù)配時(shí)的可操作性，蛋白酶的初篩條件為在最適pH 7左右，可節(jié)省調(diào)節(jié)pH的過程，選擇堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶進(jìn)行單因素試驗(yàn)。其余試驗(yàn)條件為溫度50℃、pH 7、液料比4∶1 mL/g、酶解時(shí)間5 h、酶添加量[E]/[S]=10%。

1.3.4 混料試驗(yàn)確定蛋白酶復(fù)配比例

經(jīng)過單酶試驗(yàn)后，確定酶解物ACE抑制效果最佳的3種酶，利用Design-Expert給出的設(shè)計(jì)方案進(jìn)行混料試驗(yàn)，得到三酶混合的情況下最優(yōu)配比，進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件。混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.3.5 ACE抑制率的測(cè)定

N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）是與AngⅠ有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，該物質(zhì)在340 nm處具有最大吸收峰，可被ACE催化分解。因此吸光度的變化速率可以表征FAPGG的分解。FAPGG分解速率的降低可反映多肽對(duì)ACE的抑制率。具體操作參考Shalaby等[5]的方法，并略作修改。事先配好50 mmol/L的Tris-HCI緩沖溶液，并加入NaCl，使NaCl濃度0.3 mol/L。以該緩沖溶液為溶劑配置50 mmol/L的FAPGG溶液作為底物。在酶標(biāo)板孔中依次加入10 μL、0.25 U/L的ACE溶液和10 μL待測(cè)樣品，考慮到待測(cè)樣品的量效關(guān)系、統(tǒng)一將樣品稀釋為1 mg/mL。150 μL經(jīng)過預(yù)熱的FAPGG溶液，于37℃下反應(yīng)，每隔1 min測(cè)定1次吸光度（Δ）。以超純水代替待測(cè)樣品作對(duì)照。按照式（1）計(jì)算ACE抑制率。

ACE抑制率=（1-Δ試驗(yàn)值/Δ對(duì)照值）×100% （1）

1.3.6 金屬離子對(duì)大鯢肌肉ACE抑制肽抑制效果的影響

將大鯢多肽的濃度確定在1 mg/mL，測(cè)定ACE抑制率。分別加入3 mmol/L氯化銅、氯化鐵、氯化鉀、氯化鎂、氯化鋁、氯化鋅、氯化鈉。靜置2 h后，測(cè)定ACE抑制率。通過活性保持率這一指標(biāo)表示金屬離子對(duì)大鯢肌肉ACE抑制肽的影響效果，活性保持率越小，代表該金屬離子的對(duì)ACE抑制率的負(fù)面影響越大。按照式（2）計(jì)算活性保持率。

活性保持率=靜置后ACE抑制率/靜置前ACE抑制率 （2）

1.3.7 體外模擬胃腸消化道酶系對(duì)大鯢肌肉ACE抑制肽抑制效果的影響

體外模擬胃腸消化道酶系的方法參考李瑩[6]方法并略做修改，將大鯢肌肉ACE抑制肽濃度控制在50 mg/mL，使用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2，加入大鯢多肽粉質(zhì)量0.5%的胃蛋白酶，在水浴鍋中保持37℃，時(shí)長(zhǎng)2 h。每隔0.5 h取樣1次，滅酶10 min，稀釋至濃度1 mg/mL測(cè)定ACE抑制率。2 h后，使用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7，加入多肽質(zhì)量0.5%的胰蛋白酶，水浴鍋中保持37℃，時(shí)長(zhǎng)4 h。每隔0.5 h取樣1次，滅酶10 min，稀釋至濃度1 mg/mL測(cè)定ACE抑制率并記錄。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

單因素均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，使用Excel作圖，使用Design-Expert進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析。用Duncan法進(jìn)行多重比較，標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著（p＜0.05）；標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不顯著（p＞0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢肌肉的氨基酸組成

大鯢肌肉的氨基酸組成如表2所示。有研究表明，ACE抑制肽的活性與N端的疏水性氨基酸及C端的支鏈氨基酸有關(guān)[7]。大鯢肌肉中，支鏈氨基酸為151.4 mg/g，疏水性氨基酸為380 mg/g，分別占總氨基酸含量的17.7%和44.5%，說(shuō)明大鯢是潛在的良好ACE抑制肽制備原料。

表2 大鯢肌肉氨基酸組成表

2.2 蛋白酶篩選結(jié)果

單酶篩選試驗(yàn)的結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，6種單酶的酶解效果有較為明顯差異，分別為風(fēng)味蛋白酶＞菠蘿蛋白酶＞中性蛋白酶＞糜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶，各組之間均差異顯著（p＜0.05）。因而，在后續(xù)的三酶配比中選擇風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶及中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。

圖1 不同單酶對(duì)大鯢肌肉酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

2.3 混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

混料試驗(yàn)結(jié)果與方差分析分別見表3和表4，得到的擬合方程為ACE抑制率= 52.700 00A+37.159 59B+ 41.159 59C+88.414 16AB+91.680 82AC+68.868 49BC+ 20.636 99ABC+64.760 50AB（A-B）+25.378 77AC（A-C）+61.650 00BC（B-C）。根據(jù)回歸方程得到的曲線圖和等高線圖如圖2和3所示，由圖可推測(cè)，該方程有最大值。對(duì)方程取極大值，也就是風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶質(zhì)量比為0.54∶0.23∶0.23時(shí)，理論ACE抑制率為76.50%。實(shí)際試驗(yàn)后得到，此配比下酶解液在1 mg/mL時(shí)的ACE抑制率為75.5%，與理論值較為接近，驗(yàn)證了方程具有較理想的擬合效果。經(jīng)過單因素及混料設(shè)計(jì)優(yōu)化后的酶解物在不同濃度下的ACE抑制率如圖4所示。大鯢肌肉ACE抑制肽在一定濃度范圍內(nèi)有較好的量效關(guān)系。曲線經(jīng)擬合得到的方程為y=79.462x+6.219，R2=0.928 9。由此計(jì)算出其大鯢多肽ACE抑制率的IC50值為0.55 mg/mL。

表3 混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表4 混料試驗(yàn)回歸方程方差分析

圖2 風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶曲面圖

圖3 風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶對(duì)ACE抑制率影響的等高線

圖4 不同濃度大鯢肌肉酶解物的ACE抑制率

2.4 不同金屬離子對(duì)大鯢肌肉對(duì)大鯢肌肉ACE抑制肽抑制效果的影響

如圖5所示，金屬離子環(huán)境均會(huì)不同程度降低大鯢多肽的ACE抑制率。但不同金屬離子對(duì)ACE抑制率的影響有所不同。Zn2+、Al3+、Fe2+對(duì)結(jié)果的影響較為顯著。其中，Zn2+使大鯢多肽的ACE抑制率降低為處理前的57%。Zn2+被認(rèn)為是ACE活性中心的關(guān)鍵離子。因而處于Zn2+環(huán)境可能使ACE活性增強(qiáng)，從而削弱多肽對(duì)其抑制率。

圖5 不同金屬離子對(duì)大鯢肌肉ACE抑制肽抑制效果的影響

2.5 體外模擬胃腸消化道對(duì)大鯢肌肉ACE抑制肽抑制效果的影響

一般而言，ACE抑制肽必須完整地被腸道吸收才能體內(nèi)發(fā)揮抑制ACE活力的作用。根據(jù)在消化道內(nèi)抑制效果的變化情況，ACE抑制肽可被分為3類——抑制性增強(qiáng)、抑制性降低及抑制性不變[8]。抑制性增強(qiáng)主要是因?yàn)槲改c道的環(huán)境使多肽進(jìn)一步降解成抑制效果更好的產(chǎn)物，也被稱為前藥物肽，而抑制性減弱的原因則相反。抑制性不變的ACE抑制肽源于其能抵抗住胃腸道環(huán)境的作用。如李瑩[6]從泥鰍蛋白中得到的ACE抑制肽即屬于第二種類型，而Pan等[9]從條滸苔蛋白得到的ACE抑制肽就屬于第三種類型。試驗(yàn)得到的大鯢肌肉蛋白ACE抑制肽抑制效果在胃腸道的變化情況如圖6所示。在經(jīng)過模擬的胃蛋白酶系時(shí)大鯢多肽ACE抑制率沒有顯著變化。但經(jīng)過模擬的胰蛋白酶系，其抑制率有明顯下降，極低值僅為初始時(shí)的一半左右，說(shuō)明試驗(yàn)得到的ACE抑制肽屬于所述類型中的第2種。

圖6 體外模擬胃腸道消化酶系對(duì)大鯢肌肉ACE抑制肽抑制效果的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過單因素和混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化大鯢ACE抑制肽的酶解參數(shù)。當(dāng)三酶（風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶與菠蘿蛋白酶）質(zhì)量配比為0.54∶0.23∶0.23時(shí)，產(chǎn)物具有最高的ACE抑制率，IC50值為0.55 mg/mL。金屬離子和體外模擬胃腸消化道酶系對(duì)產(chǎn)物ACE抑制率穩(wěn)定性的影響的試驗(yàn)結(jié)果顯示，Zn2+、Al3+、Fe2+離子能顯著降低大鯢多肽的ACE抑制率，胃蛋白酶系對(duì)大鯢多肽的ACE抑制率影響較小，但胰蛋白酶系能顯著降低ACE抑制率。