茯苓液體發酵培養條件優化

張詩泉，郭毓菲，汪芷玥，曾百慧，王茜，吳鵬*

黃岡師范學院生物與農業資源學院，經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，大別山特色資源開發湖北省協同創新中心（黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）又稱茯靈，屬多孔菌科[1]。我國森林資源非常豐富，很多地域具有海拔高、晝夜溫差大、雨水量充沛的特點，適宜真菌類中藥材種植和生長[2]。茯苓作為中國傳統藥材，具有抗腫瘤、增強免疫力、延緩衰老、消炎利尿等作用[3]。隨著茯苓研究深入[4]，茯苓及其提取物被廣泛應用于醫藥和保健品研發[5]。因此，消費者對于茯苓的需求量不斷增加[6]，使得茯苓具有廣闊市場前景[7]。

中國對于茯苓的培養仍以人工栽培的傳統方法為主[8]，存在生長周期長、效益低、局限于地理條件[9]、不能夠確保茯苓藥性等諸多問題[10]，不符合現代工業化生產要求[11]，不利于茯苓資源開發。而茯苓液體發酵培養技術具有周期短、成本低、工藝簡單、產量大的優勢[11-14]，采用茯苓液體發酵培養技術獲得的茯苓與人工栽培的茯苓具有相同功效，還能獲得標準化茯苓以滿足工業化生產需求[15]，茯苓液體發酵培養將成為茯苓資源開發趨勢[16-17]。

試驗以茯苓菌絲體干質量作為衡量標準，用液體發酵培養法對茯苓菌進行培養，選擇培養溫度、接種量、培養天數為影響因素，通過單因素及響應面試驗對茯苓液體發酵培養條件進行優化，為實現現代工業化生產優質茯苓提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

茯苓菌（甘油管保藏-30℃）。

葡萄糖、硝酸鈉、無水氯化鈣、維生素B1（VB1）、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（均為分析純）；蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）。

1.1.2 培養基

種子液體培養基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，在121℃條件下滅菌20 min。

初始發酵培養基：葡萄糖40 g/L，硫酸鎂1.67 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨30 g/L，硝酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，VB11 g/L，無水氯化鈣0.1 g/L，在121℃條件下滅菌20 min[18]。

1.2 儀器與設備

LX-B 50L型立式自動電熱壓蒸汽滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）；RB-CJ-1 ND型超凈工作臺（北京瑞邦興業科技有限公司）；SPX-150生化培養箱（中儀國科（北京）科技有限公司）；TG 16-WST臺式高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；D2F-6020真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；AL 204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）股份有限公司）；SHA-C數顯水浴恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化、純化及種子液

活化。將甘油保藏的茯苓菌用37℃水浴2 h，將水浴后的茯苓菌用無菌移液槍按2%接種量種于種子液體培養基內進行液體發酵，在26.5℃恒溫培養箱中培養3 d。

純化。把活化后的菌種按10%接種量接種于250 mL種子液體培養基中，在26.5℃的恒溫培養箱中培養3 d。3 d后重復此操作以得到純度高的菌種進行培養和后續優化試驗。

種子液。將50 mL種子液體培養基裝入250 mL三角瓶中，在超凈工作臺中按5%接種量無菌接種，置于26.5℃的恒溫培養箱中培養3 d，作為菌體菌種備用。

1.3.2 菌體量的測定

將所得發酵液，導入離心管中以4 000 r/min離心20 min，去上層清液，將剩于物質置于45℃真空干燥箱中干燥至恒質量，稱質量，以干菌體量表示生物量[19]。

1.3.3 茯苓液體發酵最佳培養的研究

將50 mL發酵培養基裝入250 mL三角瓶中，按5%接種量接入已培養好的菌種，用恒溫水浴搖床振蕩培養，轉速150 r/min，培養溫度26℃，培養3 d。

接種量對茯苓液體發酵的影響。依此以3%，5%，7%，9%和11%接種量在水浴溫度26℃、振蕩速度150 r/min條件下培養3 d，測定各三角瓶菌體量，確定茯苓液體發酵最適接種量。

培養天數對茯苓液體發酵的影響。以5%接種量在水浴溫度26℃、振蕩速度150 r/min條件下依此培養2，3，4，5和6 d，測定各三角瓶菌體量，確定茯苓液體發酵最適培養時間。

搖瓶溫度對茯苓液體發酵的影響。以5%接種量在水浴溫度分別為24，25，26，27和28℃，振蕩速度150 r/min條件下培養3 d，測定各三角瓶菌體量，確定茯苓液體發酵最適培養溫度。

1.3.4 響應面分析試驗設計

在單因素試驗的基礎上，得到Box-Behnken試驗的中心點，以相鄰的上下2個梯度為高低水平，以菌體量（Y）為響應值，對茯苓菌體量的影響因素培養溫度（A）、接種量（B）、培養天數（C）進行響應面分析試驗，得到最優方案。響應面設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 培養溫度對茯苓液體發酵的影響

試驗結果見圖1。培養溫度對菌絲體干質量有較大影響，達到26℃前，隨著溫度升高，菌絲體干質量不斷增加，在26℃時由最大菌絲體干質量，為7.34 g/L；溫度大于26℃后，菌絲體干質量逐漸下降。由于在不同溫度下微生物有不同生理活性，因而確定最適培養溫度26℃。

圖1 不同培養溫度對茯苓液體發酵的影響

2.1.2 接種量對茯苓液體發酵的影響

試驗結果見圖2。隨著接種量增加，菌絲體干質量增加，接種量5%～7%時，菌絲體產量較高，5%時菌絲體干質量為5.02 g/L達到峰值，綜合考慮培養時間長短和生產成本等因素后，確定最適接種量5%。

2.1.3 培養天數對茯苓液體發酵的影響

試驗結果見圖3。培養天數對菌絲體干質量有較大影響，培養天數4～6 d時有較高菌絲體干質量，并且在5 d時達到最大值7.4 g/L，培養天數大于5 d時菌絲體干質量開始下降，綜合考慮成本后，選擇最適培養天數5 d。

圖2 不同接種量對茯苓液體發酵的影響

圖3 不同培養天數對茯苓液體發酵的影響

2.2 響應面試驗優化

2.2.1 響應面試驗設計與結果

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.0軟件，以菌絲體干質量為（Y）作為響應值，對培養溫度（A）、接種量（B）和培養天數（C）3個因素進行三因素三水平的Box-Behnken試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表2，回歸模型方差分析結果見表3。

將各因素使用Design-Expert 8.0軟件進行二次多項式回歸擬合后，得到茯苓菌絲體干質量響應面回歸模擬方程：Y=7.34+0.044A-0.35B-0.16C-0.36AB+0.91AC+1.37BC+0.78A2-0.64B2-2.01C2。

由表3可知，該模型的p=0.000 1＜0.01，極顯著；失擬項p=0.077 0＞0.05，不顯著，表明該方程合理可靠。一次項B對結果影響顯著（p＜0.05），A、C對結果影響不顯著（p＞0.05），交互項AC、BC對結果影響極顯著（p＜0.01），AB對結果影響不顯著（p＞0.05），二次項A2、C2對結果影響極顯著（p＜ 0.01），B2對結果影響顯著（p＜0.05）。3個單因素對菌絲體干質量的影響主次順序為B＞C＞A，即：培養天數＞接種量＞培養溫度。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 回歸模型的方差分析

由響應面分析法求得茯苓菌發酵培養的最佳條件為：培養溫度27℃、接種量3.86%、培養天數4.99 d。理論得到菌絲體干質量為8.358 78 g/L。考慮試劑操作方便，將各因素修正為：培養溫度27℃、接種量4%、培養天數5 d。

2.2.2 響應分析

培養溫度、接種量及培養時間的交互作用對菌絲體干質量影響的響應面及等高線見圖4。

圖4直觀反映影響菌絲體干質量的3個因素兩兩交互作用，隨著培養溫度、培養時間和接種量增加，菌絲體干質量呈先升高后下降趨勢，在所采用數值間均有極值出現。沿接種量（B）方向比培養天數（C）的響應面坡度更陡，等高線也更密集，說明接種量對茯苓液體發酵培養的影響大于培養天數，與方差分析結果一致；培養天數（C）方向比培養溫度（A）的響應面坡度更陡，說明培養天數對茯苓液體發酵培養的影響大于培養溫度，與方差分析結果一致。

圖4 培養溫度、接種量及培養時間的交互作用對菌絲體干質量影響的響應面及等高線

2.2.3 驗證試驗

在由響應面分析法求得的茯苓液體發酵培養的最佳條件下進行驗證試驗，通過3次平行試驗，得出實際菌絲體干質量為8.329±0.032 g/L，與回歸方程預測值8.358 78 g/L基本吻合，所以該模型有效。

3 結論

試驗結果表明，茯苓液體發酵培養不僅和菌種基因等內在因素有關，也與菌體培養溫度、培養時間、接種量等外在條件有關。試驗以茯苓液體發酵培養后菌絲體干質量為響應值，利用響應面對茯苓液體發酵培養的條件進行優化，試驗結果表明，接種量顯著影響茯苓液體發酵培養的結果。得出最佳培養條件為：培養溫度27℃、接種量4%、培養天數5 d。接種量和培養天數的交互作用、培養溫度和培養天數的交互作用對試驗結果影響均顯著，但是接種量和培養溫度的交互作用對試驗結果影響不顯著，后續研究可考慮更換培養溫度這一條件，以期得到最佳茯苓液體發酵培養條件，為茯苓液體發酵工業化生產提供理論基礎。