響應面法優(yōu)化蘆竹中蘆竹堿提取工藝

李琳，楊培龍，李秀梅，潘方方，閆海潔*

中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所（北京 100081）

蘆竹（Arundo donax）又名蘆荻、江葦，多年生，禾本科蘆竹屬多年生植物。莖干直立挺拔，高2～6 m，莖粗1～2 cm，葉片寬大鮮綠，形似蘆葦、竹子，但屬于不同的植物。蘆竹原產(chǎn)于匈牙利[1]，在中國南方地區(qū)有亞種。燃燒熱值在16.8 kJ以上，且單位面積生物質(zhì)能產(chǎn)量高，早期作為替代煤炭的生物質(zhì)能源材料被引進中國。蘆竹喜潮，在中國主要分布在廣東、四川、浙江等地區(qū)，通?？梢蚤L到6 m。平均每年每公頃30～40 t的干物質(zhì)量[2]。蘆竹的適應性極強，由于其根系發(fā)達，蔓延性強，可以很好地吸收水分，所以耐干旱。不僅如此，蘆竹還可在鹽堿地、沙地等環(huán)境中生存[3-4]。蘆竹有多種用途，可作為生物燃料，干物質(zhì)直接燃燒熱值為3 400 kJ/kg。它是世界上生長最快的陸地植物之一，對土壤耕作、肥料和殺蟲劑的需要很少。歐盟公布蘆竹是所有能源生物質(zhì)作物中最有生產(chǎn)力和最低影響的作物[5]，并提議蘆竹成為產(chǎn)生沼氣的能源作物，自從2013年起，意大利已有25個農(nóng)場種植蘆竹[6]；蘆竹還可防止水土流失[7]，對不同pH、酸堿度、含重金屬離子的土壤具有修復作用[8]；蘆竹被用于污水處理[9]；1937—1962年，在意大利，蘆竹被用于大規(guī)模的紙張和溶解紙漿的工業(yè)基礎中；蘆竹在中國古代被當作牧草來飼喂牛羊，有研究表明，蘆竹的蛋白質(zhì)含量高，纖維含量低，可作為一種優(yōu)質(zhì)飼料原料，特別是蘆竹幼嫩的枝葉是雞、牛等喜歡的青綠飼料[10]；成熟蘆葦作為原料，以其優(yōu)良性能和管狀形狀被用作建筑材料，與竹子相似之處在于它們在建筑物中結合方式，但蘆竹更靈活；蘆竹還可用來制作樂器。

蘆竹中含有多種生物堿，如蘆竹辛、蘆竹胺、蘆竹堿等，蘆竹堿又名格胺、克胺、禾堿、禾草堿、2-二甲氨甲基吲哚，純凈的蘆竹堿為片狀或針狀白色結晶，熔點128℃，溶于醇、醚、氯仿，微溶于冷丙酮，幾乎不溶于水和石油醚[11]，中國化學家刑其毅最先完成其化學合成與結構測定[12]。蘆竹堿存在于蘆竹、羽扁豆、麥芽、排前草中，蘆竹中蘆竹堿含量遠遠高于山羊草中蘆竹堿含量[13]，具有多種生物活性[14]，是色氨酸的重要中間體，并在動物和人體的氨基酸代謝過程中發(fā)揮重要作用[15-16]。蘆竹堿具有清熱瀉火作用，中醫(yī)用于治療熱病煩渴、風火牙痛、小便不利，作用擬膽堿，可降低腎上腺素對平滑肌的影響[17]。蘆竹堿對昆蟲幼蟲，如蚜蟲有選擇性毒性作用，但對哺乳動物無毒[18]。蘆竹堿單體對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）具有抑制活性，可開發(fā)蘆竹堿類生物農(nóng)藥[19-20]。蘆竹堿還可作為防污活性物質(zhì)[21]。

對于蘆竹堿合成工藝的研究較多[22-28]，但對于蘆竹堿天然提取的方法研究很少，有學者采用氯仿或乙醇、水、冰醋酸的混合溶液提取蘆竹堿[29-30]，蘆竹堿在水中溶解性較差。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆竹（采自中國農(nóng)業(yè)科學院高新技術產(chǎn)業(yè)園）；乙醇（分析純，北京化工廠）；鹽酸（分析純，北京北化精細化學品責任有限公司）；氫氧化鈉、三氟乙酸（分析純，西隴化工股份有限公司）；蘆竹堿標準品（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；乙腈（色譜純）。

1.2 儀器與設備

SY-1000恒溫超聲提取機（北京弘祥隆生物技術股份有限公司）；高效液相色譜儀；ME-204電子天平、FE-28 pH計（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；YF114微型植物粉碎機（中國江陰市新友機械制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蘆竹堿標準曲線的制備

準確稱取0.2 g蘆竹堿溶于1 mL 70%的乙醇中，得到質(zhì)量濃度0.2 mg/mL蘆竹堿溶液，利用高效液相色譜儀測定上樣量分別為5，10，15，20和25 μL的峰面積，以蘆竹堿的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到蘆竹堿的標準曲線公式為Y=2E+07X+49 288，R2=0.998 3。

1.3.2 原料的預處理

蘆竹收割清洗后于65℃的烘箱中烘干至恒質(zhì)量，用植物粉碎機粉碎，過40目分析篩后保存于密封袋中，備用。

1.3.3 蘆竹堿的提取

按照一定料液比，稱取一定量蘆竹粗粉置于500 mL燒杯中，加入一定體積分數(shù)乙醇，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至合適pH，在一定功率和溫度下超聲提取一定時間，靜置0.5 h，取上清液于離心管中以8 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜，用高效液相色譜儀進行測定。

1.3.4 蘆竹堿的測定

高效液相色譜法。色譜柱Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A，0.1%三氟乙酸，流動相B，乙腈；檢測波長269 nm；流速1 mL/min；柱溫30℃。程序：0～25 min 5%～100% B；25～30 min 100% B。

1.3.5 單因素試驗與響應面優(yōu)化試驗

選取超聲功率、提取時間、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、液料比值、pH這6個因素對蘆竹中蘆竹堿的提取得率的影響，各個因素的水平為：超聲功率400，500，600，700和800 W，提取時間20，30，40，50和60 min，乙醇體積分數(shù)30%，40%，50%，60%，70%和80%，提取溫度30，40，50，60和70℃，液料比值20，30，40，50和60 mL/g，pH 5，6，7，8和9。根據(jù)單因素試驗，選出超聲功率、超聲時間和乙醇體積分數(shù)3個主要影響因素，利用響應面法對蘆竹中蘆竹堿的提取工藝進行優(yōu)化。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平

1.4 蘆竹堿提取率的計算

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010計算，以±s表示，采用Design-Expert 8.06對響應面結果進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對蘆竹堿提取率的影響

如圖1所示，隨著超聲功率增加，得率呈先增加后減少趨勢，因為功率越大，空化效果增強，但是太大功率會產(chǎn)生大量空化泡，減少能量的傳遞，使得率降低[31]。因此，超聲功率控制在600 W為宜。

圖1 超聲功率對蘆竹堿得率的影響

2.1.2 超聲時間對蘆竹堿提取率的影響

如圖2所示，在20～50 min超聲時間內(nèi)，蘆竹堿得率明顯上升，50 min時達到最大，之后得率隨時間增加而下降。這是因為在超聲作用下，隨著時間延長，提取液能夠更充分地滲入物料中，促進蘆竹堿溶出，然而超聲時間過長可能會導致蘆竹堿降解。因此，超聲時間控制在50 min左右。

圖2 超聲時間對蘆竹堿得率的影響

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對蘆竹堿提取率的影響

如圖3所示，乙醇體積分數(shù)30%～60%時，蘆竹堿得率隨著乙醇體積分數(shù)升高而增加，并在乙醇體積分數(shù)60%時，蘆竹堿得率達到最大，隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，蘆竹堿得率反而有所下降。原因是隨著乙醇體積分數(shù)增大，溶解在有機溶劑中的蘆竹堿量會隨之增加，但乙醇體積分數(shù)增大到一定限度時，蘆竹中其他物質(zhì)會被提取出來，反而影響蘆竹堿得率。因而選取乙醇體積分數(shù)60%為宜。

圖3 乙醇體積分數(shù)對蘆竹堿得率的影響

2.1.4 超聲溫度對蘆竹堿提取率的影響

如圖4所示，隨著溫度升高，蘆竹堿得率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，50℃時達到最大值。這是因為隨著溫度升高，體系黏度降低，加速傳質(zhì)過程[32]。溫度過高可能會破壞蘆竹堿結構，同時雜質(zhì)浸出量增加，故選取最佳超聲溫度50℃為宜。

圖4 超聲溫度對蘆竹堿得率的影響

2.1.5 液料比值對蘆竹堿提取率的影響

如圖5所示，液料比值20～40 mL/g范圍內(nèi)，液料比值對蘆竹堿得率影響不大，隨著料液比繼續(xù)增大，得率下降?？紤]到后續(xù)濃縮回收工藝難度和節(jié)約原料原則，選擇液料比值40 mL/g為宜。

圖5 液料比值對蘆竹堿得率的影響

2.1.6 pH對蘆竹堿提取率的影響

如圖6所示，在pH 5～9范圍內(nèi)，pH對蘆竹堿的得率影響不大，因此選擇pH 5左右。

圖6 pH對蘆竹堿得率的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗

采用Design-Expert 8.06統(tǒng)計分析軟件中響應曲面法的Box-Behnken模式，綜合單因素試驗結果，選取對蘆竹堿得率影響顯著的3個因素——超聲功率（A）、超聲時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C），建立三因素三水平中心組合試驗設計，共包括17個試驗方案，其中12個析因試驗點，5個中心試驗點。試驗設計方案及試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

以蘆竹堿得率為響應值，建立影響因素和蘆竹堿得率間的數(shù)學模型：Y=-1.166 88+4.689 98E-003A+ 0.015 266B+9.743 18E-003C-2.243 75E-006AB+ 1.373 77E-005AC-6.637 50E-006BC-4.252 66E- 006A2-1.291 36E-004B2-1.539 76E-004C2。

由表3可知，該模型p＜0.000 1，說明該二次回歸方程極顯著，失擬項（p=5.42＞0.05）顯著，說明未知試驗因素對試驗結果干擾很小。決定系數(shù)R2=0.995 4，說明該模型對試驗擬合情況較好，較好地反映蘆竹堿得率與超聲功率、超聲時間和乙醇體積分數(shù)的關系。

表3 回歸統(tǒng)計分析表

從表3中可以看出，超聲功率、超聲時間、乙醇體積分數(shù)、超聲功率二次項、超聲時間二次項、乙醇體積分數(shù)二次項、超聲功率與乙醇體積分數(shù)交互項對響應值影響極顯著，其他因素的影響不顯著。

2.2.2 響應面分析

圖7（a）～（c）反映在試驗范圍內(nèi)3個因素的交互作用，同時第3個因素固定在零水平。綜合比較6組圖可知，等高線圖c最圓，說明乙醇體積分數(shù)與超聲時間的交互作用對提取蘆竹中蘆竹堿得率的影響最小，而等高線圖b呈橢圓形，說明超聲功率與超聲時間的交互作用對提取蘆竹中蘆竹堿得率的影響最大。各因素對響應值的影響順序為：超聲功率＞乙醇體積分數(shù)＞超聲時間。

圖7 各兩因素交互作用對蘆竹堿得率影響的響應面及等高線圖

2.2.3 最佳提取工藝驗證

根據(jù)模型預測超聲提取蘆竹中蘆竹堿的最佳工藝條件是：超聲功率632.54 W、超聲時間58.73 min、乙醇體積分數(shù)52.10%。在此條件下蘆竹堿得率的預測值為1.000 25%。根據(jù)實際情況，調(diào)整優(yōu)化條件為：超聲功率600 W、超聲時間5 min、乙醇體積分數(shù)60%、超聲溫度50℃、液料比值40 g/mL、pH 5。重復3次，進行驗證試驗，蘆竹堿的實際得率為1.02%，與理論預測值接近（相對誤差1.96%），說明響應面分析法適用于對蘆竹中蘆竹堿超聲提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結論

試驗利用超聲提取蘆竹中的蘆竹堿，并考察單因素對蘆竹堿得率的影響，在此基礎上，通過響應面分析法得到蘆竹堿最佳提取工藝為：超聲功率600 W、超聲時間50 min、乙醇體積分數(shù)60%、超聲溫度50℃、液料比值40 mL/g，pH 5。在此條件下，蘆竹中蘆竹堿得率為1.00%。試驗采用Box-Behnken響應面法對蘆竹中蘆竹堿的提取工藝進行優(yōu)化，為進一步開發(fā)提供科學、合理的理論和試驗依據(jù)。