基于CRISPR/Cas9技術的煙草CPS2基因敲除及功能分析

張思琦，何 佳，賀凌霄，薛 剛，孫聚濤，李曉輝，段杜薇，徐世曉*

1.河南農業大學煙草學院，鄭州市金水區文化路95 號 450002

2.河南中煙工業有限責任公司，鄭州市鄭東新區榆林南路16 號 450000

冷杉醇為賴百當類二萜化合物，是煙草葉面分泌的一種化學物質，多存在于香料煙和部分雪茄煙中，烤煙、白肋煙、馬里蘭煙中一般不存在［1］。經調制和醇化后，90%以上的冷杉醇、賴百當烯二醇氧化降解，產生多種降賴百當類化合物，其中降龍涎香醚、龍涎香內酯等物質具有強烈的龍涎香氣［2］。Sallaud 等［3］通 過 轉 化 二 倍 體 林 煙 草（Nicotiana sylvestris），發現CPS2 和ABS 基因直接參與冷杉醇的合成。在賴百當類合成途徑中，香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）折疊成環在柯巴基焦磷酸合酶（CPS2）催化作用下合成8-OH-CPP（8-羥基-柯巴基焦磷酸）；在冷杉醇合成酶（ABS）和香紫蘇醇合成酶（SCLS）催化作用下，8-OH-CPP 分別合成冷杉醇和賴百當烯二醇［4］。

CRISPR/Cas9 是利用向導RNA（gRNA）與基因靶位點序列結合，在Cas9 蛋白的作用下對靶DNA 分子進行剪切，DNA 分子發生斷裂后會自動進行修復，在修復過程中可能會出現堿基的插入、缺失和替換，這可能會導致翻譯提前終止，進而使原有的基因功能喪失［5-6］。CRISPR/Cas9 技術廣泛應用于作物遺傳改良和品種培育［7-10］。Wang 等［11］敲除小麥中3 個TaMLO 同源白粉病易感基因，得到了對白粉病具有抗性的小麥；ZHOU 等［12］創建了水稻溫敏核雄性不育系；Shi 等［13］獲得了玉米AGROS8 突變體，該突變體對乙烯利的敏感性降低，抗旱性提高，在干旱脅迫下籽粒產量仍較高。CRISPR/Cas9 技術在煙草上也有較多應用。潘陽等［14］對腺毛負向調控基因NtCycB2 進行敲除，提高了煙草腺毛密度，同時中性香氣成分含量提高。聶夢云等［15］敲除萜類合成基因NtDXR 后，獲得白化煙株，推測NtDXR 基因的突變能阻斷煙草質體色素的合成；王姍姍等［16］對煙草腋芽形成關鍵基因NtLS 進行敲除，得到部分蛋白翻譯錯誤的T0代突變植株。8306 品熙是以葉面分泌物為指標，經定向選育獲得的烤煙新品系，其西柏烷類化合物和石油醚提取物含量提高，同時中性香氣物質總量和重要致香物質如茄酮，巨豆三烯酮等含量提高［17-18］。與常規烤煙品種不同，8306 品系能夠合成冷杉醇，對卷煙香氣有負面影響［19-20］。柯巴基焦磷酸合酶基因（CPS2，copal-8-ol diphosphate hydratase）可編碼冷杉醇，在烤煙基因組中為單拷貝。目前對煙草CPS2 基因功能及相關分子調控機制的研究尚鮮見報道。為此，利用CRISPR/Cas9技術對煙草CPS2 基因進行敲除，旨在明確CPS2基因在煙草萜類代謝途徑中的作用，消除8306 品系煙葉雜氣，改良煙草香氣品質。

1 材料與方法

1.1 煙草材料及載體試劑盒

8306 為河南農業大學自選高香氣烤煙品系，CRISPR/Cas9 載體試劑盒和檢測引物由武漢天問生物科技有限公司合成。在河南農業大學育種實驗室進行無菌育苗，置于恒溫恒濕人工光照培養箱內，光周期為14 h 光照/10 h 黑暗；光照強度為1 500 Lx，溫度為（27±1）℃。

1.2 CRISPR/Cas9 載體構建

根據NCBI 提供的mRNA 序列及對應的基因組序列信息，設計2 個CRISPR 靶位點，以提高基因打靶效率。靶位點1 序：GGAAACCCAAGCTGTGTC AT；靶位點2序列：CATGAACCATCAGAAAGTTG。設計載體構建的PCR 引物以及陽性克隆測序引物（表1），引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，引物合成后，采用重疊延伸PCR 擴增出含有靶位點的片段，PCR 片段利用南京諾維贊生物科技有限公司的重組酶克隆至最終的CRISPR 表達載體。將構建的CRISPR 載體轉入大腸桿菌，通過菌落PCR 篩選陽性克隆。具體方法：利用Golden Gate 克隆法，將兩個sgRNA 組合在1 個載體中，分別用引物對P1-P2 和P3-P4 獲得兩個單獨的PCR產物。使用重疊延伸PCR 法利用引物對P5-P6 將這兩個片段連接，擴增出含有靶位點的片段。將目標序列連接到兩個Bsa I 酶切位點之間，連接方法為一步克隆法。為進一步確定靶位點的準確性，靶位點片段與表達載體重組后，轉化大腸桿菌TOP10，挑選4 個克隆，利用載體引物KN48-inf T2 as 進行 菌落PCR 驗證。

表1 PCR 擴增引物Tab.1 PCR primers

1.3 農桿菌介導的遺傳轉化

參照曾千春等［21］方法，成熟種子使用加入75%酒精和10%的次氯酸鈉進行消毒后，接種于萌發培養基，光照（光周期為14 h 光照/10 h 黑暗；光照強度為1 500 Lx）下培養45 d。使用打孔器取0.5 cm 左右的葉片，轉入預培養基，培養2 d。在含50 mg/L 卡那霉素培養基上活化農桿菌。農桿菌菌液侵染葉盤，棄去菌液，轉入共培養基培養3 d。用滅菌蒸餾水及含有抗生素的水溶液清洗葉盤，吸干葉盤表面水分后，轉入篩選培養基培養，待分化后轉入生根培養基培養。經生根培養獲得轉化植株，培養1個月后至盆缽中土培。

1.4 轉化植株目標基因靶位點序列突變檢測

轉化植株于2017 年5 月上旬移栽于河南農業大學科教園區大棚盆缽中，常規水肥管理。在苗期剪取轉化植株葉片，使用Plant DNAIsolation Reagent（日本TAKARA公司）提取煙草葉片DNA，利用CTAB法抽提DNA。設計特異引物NPTII 序列，進行PCR 陽性檢測。NPTII-dF：ACTGGGCACAACAGACAATCG；NPTII-dR：GCATCAGCCATGATGGATACTTT。待確認外源DNA 片段插入后，為了檢測靶位點的突變情況，根據CPS2 基因序列及靶位點位置，設計引物17KN48序列對陽性植株進行PCR檢測。17KN48-dF：ATCATAGCGGAATTGTTTGTCTC；17KN48-dR：TCC GTATAGATACCTAAGCGATCTG。將擴增出的目的條帶進行純化，送至北京擎科生物公司測序。利用BioEdit 7.0 軟件將測序結果與模板序列進行比對。PCR 擴增體系20μL：1μL DNA，2μL 10×PCR buffer，0.4 μL dNTP mixture，正反引物各0.2μL，0.2 μL rTaq DNApolymerase，加DEPC水補充至20μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。配制1%的瓊脂糖凝膠，放置電泳槽中進行電泳檢測。

1.5 轉化植株二萜類關鍵基因相對表達量測定

待轉化植株葉齡60 d 時，取中部葉置于液氮中速凍，然后存放于-80 ℃冰箱中，備用。采用CTAB法提取葉片總RNA，反轉錄使用PrimerScript RT reagent Kit（日本TaKaRa 公司）將上述RNA 反轉錄為cDNA。熒 光 定 量PCR：設 計CPS2、ABS、CYC-1、CYP71D16、DXR 和Actin（內參基因）序列引物（表2）。反應體系為20 μL。包括2.0 μL 10×PCR Buffer，1 μL Mg2+，0.5 μL dNTPs，0.3 μL SYBR（20×），正反引物各0.5 μL，0.2 μL Taq DNA Polymerase，1 μL Template，14 μL ddH2O。PCR 程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40 個循環；循環結束后利用熔解曲線，從60 ℃緩慢升溫至95 ℃，每次采集5 次熒光信號。依據Ct 值，計算相對表達量，并作圖。

表2 熒光定量引物序列Tab.2 Sequences of primers for fluorescence quantitative PCR

1.6 轉化植株葉面分泌物及GGPP 含量測定

選取葉齡60 d 時轉化植株的中部葉，一部分沿主脈兩側剪切成葉圓片。另一部分將鮮葉用液氮速凍，冷凍干燥并打碎。將葉圓片置于500 mL 二氯甲烷中浸提，參照韓錦峰等［22］的方法，每片葉圓片每次浸提2 s，反復浸提4 次。收集二氯甲烷溶液，向其中加入1 mL 含正-17-烷醇的內標，同時加入10 g 無水硫酸鈉。過濾，將濾液置于旋轉蒸發儀中濃縮至50 mL，經氮吹儀吹干和衍生化反應后，使用GC/MS 聯用儀（美國Agilent 公司HP-5890Ⅱ-5972）采用內標法進行定量分析［23］。同時取0.05 g 鮮葉液氮樣研磨成粉末，加入1 mL 甲醇溶劑測定香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）含量（質量分數）。

1.7 農藝性狀調查

轉化植株葉齡60 d 時，按照標準方法［24］測定株高、莖圍、腰葉長、腰葉寬、有效葉片數和節距等指標。

1.8 數據處理

采用SPSS Statistic 17.0 對數據進行統計分析，采用新復極差法分析均值差異的顯著性，采用Excel 2007 軟件繪圖制表。

2 結果與分析

2.1 gRNA 靶位點選擇及表達載體構建

根據cds 序列與基因組序列（CPS2，Genebank HE588139.1）在第2 外顯子區域設計2 個gRNA 靶位點序列。靶點長20 bp，靶位點1 序列為GGAAACCCAAGCTGTGTCAT，靶位點2 序列為CATGAACCATCAGAAAGTTG。靶位點在cds 區域的位置見圖1，分別構建靶點1 和靶點2 的表達載體pRGEB32-Cas9-NPT II-CPS2-gRNA，見圖2。利用靶位點接頭引物，擴增中間載體獲得含有靶位點的片段，大小約300 bp 的片段（圖3），表明2個靶點gRNA 元件順利插入到載體上。圖4 顯示，篩選到2 個陽性克隆菌落，PCR 產物大小約400 bp，挑選出的4 號克隆測序結果表明，2 個靶位點序列都與所設計靶點序列相同，說明構建的pRGEB32/Cas9-CPS2-gRNA 載體可進行下一步農桿菌介導的遺傳轉化。

圖1 2 個gRNA 靶點在CPS2 基因中的位置Fig.1 Positions of the two gRNA targets in CPS2 gene

圖2 pRGEB32-Cas9-NPT II-CPS2-gRNA 重組載體構建Fig.2 Construction of recombinant vector pRGEB32-Cas9-NPT II-CPS2-gRNA

圖3 靶位點片段擴增Fig.3 Amplification of target fragment

圖4 菌液PCR 檢測Fig.4 Bacterial liquid PCR detection

2.2 轉化植株靶位點序列突變的差異分析

將所獲得36 株T0代轉化再生植株進行PCR陽性檢測，電泳結果見圖5、圖6。最終得到31 株為陽性轉化植株，靶位點中間序列缺失后擴增產物大小約356 bp。對陽性植株CPS2 基因進行測序表明，T0代共獲得7 株成功敲除植株，突變比例達22.6%。突變均發生在靶點2 上，其中T0-26、T0-27、T0-36、T0-42 插入單個A 堿基，T0-45、T0-46插入單個C 堿基，T0-47 插入單個T 堿基（圖7）。根據峰型圖及子代株系測序結果，確定T0-26 為純合型堿基插入，其余為雜合型堿基插入。對突變株系編碼蛋白的氨基酸序列進行預測比對，結果見圖8。由于靶點2 插入單個堿基A/T/C 引發移碼，致使編碼肽鏈提前遇到終止密碼子，翻譯的氨基酸鏈大幅縮短。

圖5 T0代轉化植株PCR 陽性檢測Fig.5 Identification of T0 generation transformed plants by PCR detection

圖6 T0代轉化植株靶位點區域PCR 檢測Fig.6 PCR detection at target sites in T0 generation transformed plants

圖7 靶位點區域PCR 產物測序文件解碼結果Fig.7 Decoding results of sequencing files for PCR products of target sites

圖8 8306 與T0代轉化植株預測氨基酸序列分析Fig.8 Analysis of the predicted amino acid sequences of 8306 and T0 generation transformed plants

2.3 轉化植株二萜類物質關鍵基因的差異表達分析

qPCR 檢測結果見圖9，DXR 是脫氧木酮糖磷酸代謝途徑（DXR）中二萜類化合物合成的上游關鍵基因。與未編輯植株8306 相比，T0代轉化植株DXR 相對表達量均上調。CYC-1 和CYP71D16 共同控制西柏烷類化合物的合成。CYC-1 以T0-46、T0-47 的表達量最高，T0-36 和T0-46 與對照相比表達量差異不大，T0-26、T0-27 和T0-45 與對照相比表達量均顯著下降。CYP71D16 以T0-27 植株表達量最高，其他植株表達量與對照間差異不大。CPS2 和ABS 共同控制賴百當類化合物的合成。與8306 相比，T0代轉化植株CPS2 的基因相對表達量顯著降低，說明T0代轉化植株中CPS2 轉錄受到抑制。同時ABS 的基因相對表達量也大幅降低，說明敲除CPS2 的同時也影響冷杉醇下游基因ABS的表達。

圖9 8306 與T0代轉化植株二萜類物質關鍵基因表達差異比較Fig.9 Comparison of expressions of key diterpenoids genes among 8306 and T0 transformed plants

2.4 轉化植株葉面分泌物及GGPP含量的差異分析

如圖10 所示，賴百當類物質主要包括冷杉醇和賴百當烯二醇，T0代轉化植株冷杉醇和賴百當烯二醇含量較8306 顯著降低，T0-45 冷杉醇含量最低。西柏烷類化合物包括西柏三烯一醇和西柏三烯二醇，與對照相比T0-46、T0-42、T0-47、T0-36 西柏三烯一醇含量顯著升高，其余植株差異不顯著；西柏三烯二醇含量除T0-27 差異不顯著外，其余均出現小幅降低；T0-42 蔗糖酯類物質含量顯著升高，T0-47、T0-45 顯著降低，其余植株差異不顯著；T0-42 和T0-46 烷烴類物質含量顯著升高，而T0-26、T0-27、T0-36、T0-45 和T0-47 顯著降低。與對照相比T0代轉化植株GGPP 含量均顯著升高，且T0-47 的GGPP 含量最高。

總體來看，敲除CPS2 后，冷杉醇和賴百當烯二醇含量減少，萜類合成前體GGPP 含量大幅提高，而西柏三烯一醇含量差異較大，西柏三烯二醇出現小幅降低。蔗糖酯、烷烴等其他代謝物質變化無明顯規律。

2.5 轉化植株農藝性狀指標分析

農藝性狀指標調查結果見表3。與8306 相比，T0代轉化植株的株高、莖圍、葉間距、最大葉長、最大葉寬均增加；T0-27、T0-45 和T0-46 的留葉數均增加1 片，其他植株留葉數有所減少。

3 討論

圖10 8306 與T0代轉化植株葉面分泌物及香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）差異比較Fig.10 Comparison of leaf surface exudates and GGPP among 8306 and T0 generation transformed plants

表3 8306 與T0代轉化植株的農藝性狀的比較Tab.3 Comparison of agronomic traits among 8306 and T0 transformed plants

本研究中利用CRISPR/Cas9 技術，共獲得了7株靶位點序列突變的煙株，突變比例達22.6%。CPS2 基因的突變均發生在PAM 上游第3 堿基和第4 堿基之間，突變類型為單堿基A/T/C 的插入，以單堿基A 或T 插入所占比例最大，這與前人的研究結果基本一致［25-26］。對氨基酸序列進行預測，由于靶點2 插入單個堿基A/T/C 引發移碼，致使編碼肽鏈提前遇到終止密碼子，翻譯的氨基酸鏈大幅縮短。

本研究中T0轉化植株CPS2 表達量均顯著低于8306，說明對目的基因定向編輯后，其基因表達量水平顯著降低，這與姚恒等［27］、宋凡等［28］、汪秉琨等［29］的研究結果一致。除此之外，ABS 的表達量也顯著降低，其冷杉醇和賴百當烯二醇含量也顯著降低，說明敲除CPS2 也會抑制ABS 基因的表達，引起賴百當類物質含量降低。T0轉化植株DXR 表達量均顯著升高，GGPP 含量也大幅提升，說明敲除CPS2 并抑制賴百當類物質合成途徑后，促進了上游途徑中萜類物質合成前體GGPP 的積累。敲除CPS2 會抑制賴百當類物質合成，由于對共同底物GGPP 的競爭減少，預測西柏烷類物質含量可能會適度增加。然而，西柏三烯一醇含量變化并無規律性，西柏三烯二醇除1 株差異不顯著外其他均小幅降低。推測可能的原因是由于編輯技術上的差異，造成個體間西柏烷類物質含量差異；或者敲除CPS2 可能在一定程度上抑制了二萜類合成酶活性，抑制西柏烷類和賴百當類物質合成，同時積累的GGPP 有可能向其他萜類合成途徑轉化。敲除CPS2 對植株農藝性狀會產生影響，T0代轉化植株較未編輯8306 表現為株高、莖圍、葉間距、最大葉長、最大葉寬均顯著增加。這表明敲除CPS2 后使煙株的表型也發生了變化。

根據轉化植株測序峰型及其子代株系測序結果，獲得了1 株純合型和6 株雜合型突變體。這些突變體的遺傳后代群體可進行后續表型和功能的驗證。而有關純合型轉化株系的無標記基因篩選以及在其自交后代中的穩定遺傳和高香氣品種繁育應用方面尚有待進一步研究。鑒于Cas9 蛋白與gRNA 可能發生錯配導致脫靶效應，以及CRISPR系統有可能對靶位點再次剪切導致新的突變，因而對于靶修飾位點的遺傳穩定性還需進一步試驗驗證。

4 結論

利用CRISPR/Cas9 技術對高香氣烤煙品系8306 中的CPS2 基因進行敲除，得到7 株靶位點單堿基A/T/C 插入的轉化植株。①CPS2 及ABS 表達量顯著降低，其冷杉醇和賴百當烯二醇含量也顯著降低，敲除CPS2 后可抑制賴百當類化合物的合成。②DXR 表達量顯著升高，GGPP 含量也大幅提升，敲除CPS2 有助于上游途徑中萜類物質合成前體GGPP 的積累。③CYC-1 和CYP71D16 表達量差異較大，西柏三烯二醇出現小幅降低，敲除CPS2可能抑制西柏三烯二醇積累。④T0代轉化植株的株高、莖圍、葉間距、最大葉長、最大葉寬均增加，敲除CPS2 會使植株表型性狀發生變化。