人工氣候室條件下K326 和云煙87 烤煙品種吸收Se（Ⅵ）的動力學分析

韓 丹，熊雙蓮，郭笑恒，涂書新，許自成*，李志斌

1.河南農業大學煙草學院，鄭州市文化路95 號 450002

2.華中農業大學資源與環境學院，武漢市洪山區獅子山街1 號 430070

植物在生長發育過程中，除大量元素外Zn、Cu、Mn、Fe、Se 等中微量元素亦必不可少。作為作物生長發育必需的微量元素之一，適量施用硒能調控植物呼吸和光合作用、抵御自由基過氧化傷害、提高作物抗逆性、提高產量，改善品質［1-2］。有研究表明，外源硒的施用能有效提高烤后煙葉安全性，施用適量硒肥能有效促進大田烤煙生長，改善烤后煙葉化學成分協調性［3］。植物主要從土壤中吸收利用有效態硒，由于其形態不同其吸收途徑也不同［4-5］。目前生產中應用的硒肥多為硒酸鹽Se（Ⅵ）和亞硒酸鹽Se（Ⅳ）。有研究認為，與Se（Ⅳ）相比，植物對Se（Ⅵ）的吸收和轉運速率更高，植物根系吸收Se（Ⅵ）后可直接通過木質部運輸到葉片的葉綠體中，而根系吸收Se（Ⅳ）在根系中轉化為有機硒化物，大部分留在根系中［6-7］，因此明確烤煙吸收Se（Ⅵ）的特征對富硒煙葉生產具有重要意義。

早在20 世紀50 年代，Epstein 和Hagen 在植物對離子的吸收研究中引入酶促反應動力學方程，Caassen 等［8］構建了植物吸收養分離子模型，以最大吸收速率(Vmax)和米氏常數(Km)定量描述植物根系對養分離子的吸收動力學特征，以此闡明環境條件對根系養分吸收的影響。目前關于煙草根系對硒的吸收機理已開展了大量研究［9-13］，Han 等［9］和Jiang 等［10］發現隨著土壤中硒濃度的增加，烤煙根系中硒濃度呈顯著增加的趨勢；馬一瓊等［11］研究表明，煙株根系中硒含量隨施硒水平增加而增加，而高硫水平則會抑制煙株對硒元素的吸收；羅勇等［12］研究認為，低濃度硒（1 mg/L）處理促進煙草生長發育，而高濃度則抑制；樊俊等［13］研究表明，相同濃度下Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）處理均能有效提高煙株各部位硒含量，Se（Ⅵ）處理較Se（Ⅳ）提高了3～30 倍。但關于不同環境條件下對煙草根系吸收Se（Ⅵ）的動力學參數的影響則鮮見報道。鑒于此，選取云煙87 和K326 為試驗材料，通過水培試驗，在不同pH、陪伴離子和抑制劑等條件下，對煙株根系吸收Se（Ⅵ）的動力學特征參數差異進行試驗，旨在揭示不同環境條件下，烤煙根系吸收Se（Ⅵ）的動力學參數的變化規律和生物化學機制，為烤煙生產合理利用硒肥和改善煙葉品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草（Nicotiana tabacum L.）品種為K326和云煙87。Se（Ⅵ）供體為硒酸鈉（Na2SeO4，美國Sigma 公司）。

1.2 試驗設計

將烤煙種子于25 ℃催芽，發芽后于蛭石+珍珠巖（1+1）的基質中培養，待植物長出1 片真葉時移栽至體積為10 L 的避光塑料盆中，選擇大小一致的煙苗用1/4 Hoagland 營養液培養3 d 后，更換成1/2 Hoagland 營養液，3 d 后更換為全量營養液。生長期間每5 d 更換1 次營養液，每天用水泵及時通氣，并補充水至10 L。育苗期間用去離子水澆灌，煙苗培養均在人工氣候室中進行，光照條件為4 000 Lx、12 h/d，相對濕度為75%，在營養液中長至四葉一心時，選取大小均勻、長勢一致的幼苗進行吸收動力學試驗。采用離子耗竭法研究不同烤煙品種對Se（Ⅵ）的吸收動力學特征，硒濃度經預備試驗確定為100μg/L。

Hoagland 營 養 液 組 成［14］：5 mmol/L KNO3、1 mmol/L NH4NO3、4 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、1 mmol/L NH4H2PO4、2 mmol/L MgSO4·7H2O、0.009 mmol/L MnCl2·4H2O、0.046 mmol/L H3BO3、0.000 8 mmol/L ZnSO4·7H2O、0.000 3 mmol/L CuSO4·5H2O、0.0001mmol/LH2MoO4、0.01mmol/LFe-EDTA。

處理方案：①選擇大小均勻的云煙87 和K326烤煙幼苗，用去離子水仔細沖洗根部，并換成超純水饑餓培養12 h，濾紙吸干水分后分別放入含有硒酸鹽100 mL 0.5 mmol/L 硝酸鈣中培養24 h，設置4 次重復，分別于試驗的0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h 從溶液中吸取1 mL測定硒含量（體積分數）。同時補充1 mL 蒸餾水，每隔1 h 補充因蒸發、蒸騰而損失的水分，以保持溶液總體積為100 mL。試驗結束后測定植株根鮮質量，并計算吸收動力學參數。

烤煙根系硒累積量：

Mi=（Co-Ci）×0.2/FW

式中：Mi 為i 時刻單位鮮質量根系的硒累積量；Ci 為i 時刻溶液的硒濃度（體積分數）；Co 為初始時刻溶液的硒濃度（體積分數）；FW 為根的鮮質量［15］。

②取樣時間及方法同①，pH 設置為pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0 和pH 8.0，pH 5.0 和pH 6.0 為2.5 mmol/L MES（含0.5 mmol/L Ca（NO3）2）緩沖溶液處理；pH 7.0 和pH 8.0 為2.5 mmol/L HEPES（含0.5 mmol/L Ca（NO3）2）緩沖溶液處理。分別用NaOH或HCl 調至相應的pH；

1.3 測定方法

采用氫化物發生-原子熒光分光光度計（AFS820，北京Titan 儀器公司）測定硒含量（質量分數）［14］。

1.4 吸收動力學參數的計算

參照張木［15］和韓丹［16］的方法計算吸收動力學參數：載體飽和時最大吸收速率Imax、解離常數Km和最小吸收濃度Cmin。

計算公式：

Imax=-bV/m

式中：b 為擬合一元二次方程的常數；V 為吸收試驗溶液體積（0.1 L）；m 為根鮮質量。

Km=a-3b2/16c

式中：a、b 和c 為擬合一元二次方程的常數。

Cmin=a-b2/4c

式中：a、b 和c 為擬合一元二次方程的常數。

1.5 數據處理

采用Excel 2010 和SAS 8.1 軟件進行數據處理和統計分析；采用Duncan’s 法進行數據間差異的多重比較(P＜0.05)；采用Origin 9.0 軟件進行分析繪圖。

2 結果與討論

2.1 不同烤煙品種吸收Se（Ⅵ）的動力學參數變化

圖1 表明，隨著處理時間的增加，兩個烤煙品種根系的硒積累量呈逐漸增加的趨勢，在營養液處理培養24 h 時后趨于飽和。不同烤煙品種間硒累積量存在顯著差異，云煙87 硒累積量顯著高于K326（P＜0.05），云煙87 對Se（Ⅵ）硒源的飽和累積量達到10.2μg/gFW，為K326 的1.7 倍。然而黎妍妍等［17-18］的研究卻發現，與云煙87 相比，K326 對Se（Ⅳ）的吸收速率更高，對硒的富集能力也更強。這可能是因為K326 對Se（Ⅳ）硒源更敏感，而云煙87對Se（Ⅵ）硒源較敏感。另外，同黎妍妍等［17］研究結果相比，烤煙對Se（Ⅳ）硒源飽和累積量只有Se（Ⅵ）硒源飽和累積量的40%～50%，這表明烤煙根系對Se（Ⅵ）吸收累積能力更強［14］?？赡茉蚴菬煵莞滴盏奈猁}主要被轉移到煙草地上部加以轉化利用，以供給其他組織器官；而亞硒酸鹽被植物根系吸收后，在根系直接被轉化利用，只有極小部分會被轉運到地上部加以利用［6］。

圖1 不同烤煙品種硒累積量的動態變化Fig.1 Dynamic changes of Se accumulation in different flue-cured tobacco cultivars

不同品種烤煙對Se（Ⅵ）吸收動力學參數見表1。對不同烤煙品種的吸收動力學參數進行t 檢驗，結果表明云煙87 的Imax值較K326 顯著提高55.01%，說明云煙87 對Se（Ⅵ）的吸收潛力較大；同時，云煙87 的Km和Cmin值均顯著低于K326，說明與K326 相比，云煙87 對Se（Ⅵ）有更強的親和力。而黎妍妍等［17］的試驗發現，與云煙87 相比，K326 對Se（Ⅳ）的吸收潛力和親和力更強，與本試驗的結果不一致。

Imax、Km及Cmin是植物對土壤中營養條件適應能力的指標［19］。Cacco 等［20］對植物的離子吸收過程中Imax和Km表現出的不同情況提出了4 種假設：①高Imax和低Km類植物，適應于大部分營養環境條件；②高Imax和高Km類植物，適應于高營養環境條件；③低Imax和低Km類植物，適應于低濃度的養分環境條件；④低Imax和高Km則在任何濃度條件下均是不利的。在本研究中，與K326 相比，云煙87 屬于高Imax和低Km的煙草品種，說明云煙87 對六價硒Se（Ⅵ）的營養條件適應范圍較K326 更為廣泛，但K326 和云煙87 兩個烤煙品種在吸收四價硒Se（Ⅳ）時，云煙87 屬于高Imax和高Km烤煙品種，因此云煙87 僅適應高濃度Se（Ⅳ）的養分條件［17］。

2.2 不同pH 對烤煙根系吸收Se（Ⅵ）動力學參數的影響

圖2 表明，隨著處理時間的增加，云煙87 和K326 的硒累積量趨于飽和，且均呈現出硒積累量為pH 6＞pH 7＞pH 8＞pH 5 的分布格局。在不同pH條件下，培養24 h 后兩個烤煙品種硒積累量差異達到顯著水平（P＜0.05）。說明在Se（Ⅵ）硒源的條件下，酸性條件（pH 5）對兩個烤煙品種根系的硒積累量抑制作用最大，而弱酸性（pH 6）及中性條件（pH 7）下云煙87 和K326 對Se（Ⅵ）的吸收最為有利。這與黎妍妍等［17］研究云煙87 和K326 對Se（Ⅳ）的吸收試驗結果一致，即弱酸（pH 6）及中性（pH 7）是烤煙對Se（Ⅳ）的吸收累積較適宜的pH條件。這進一步驗證了Fordyce 等［21］的研究結果，當pH 越接近中性，硒對植物的有效性越高，越容易被植物吸收利用。

表1 烤煙根系吸收Se（Ⅵ）的動力學參數①(n=4)Tab.1 Kinetic parameters of Se(Ⅵ)uptake by flue-cured tobacco roots(n=4)

圖2 不同pH 條件下烤煙根系硒累積量的動態變化Fig.2 Dynamic changes of Se accumulation in flue-cured tobacco roots at different pH values

不同pH 條件下烤煙吸收Se（Ⅵ）動力學參數變化趨勢見表2。云煙87 和K326 兩個烤煙品種Imax值呈現先升高后降低的趨勢，在pH 6 時均顯著高于其他處理，說明云煙87 和K326 均是在pH 6的條件下對Se（Ⅵ）有較快的吸收速率；而pH 6 時云煙87 和K326 的Km和Cmin均顯著(P＜0.05)低于其他處理，說明在pH 6 時兩個烤煙品種對Se（Ⅵ）的親和力最強，更利于烤煙對Se（Ⅵ）的吸收；在pH為5.0～8.0 范圍內，云煙87 的Imax值顯著高 于K326，pH 6 處理提高54.99%，而Km和Cmin則顯著低于K326，pH 6 處理的云煙87 的Km和Cmin較K326分別顯著降低65.19%和76.29%，說明在pH 為5.0～8.0 范圍內，與云煙87 相比K326 對Se（Ⅵ）硒源的親和力較強。因此在不同pH 條件下，pH 6 和pH 7 更有利于烤煙對Se（Ⅵ）的吸收積累。有研究表明，在堿性和氧化環境中，硒酸鹽Se（Ⅵ）是硒的主要形態，且在不同pH 條件下硒酸鹽存在形式不同，其吸收機制亦不相同［22-23］，本試驗中不同pH條件影響不同烤煙品種對Se（Ⅵ）的吸收，除烤煙品種本身存在差異外，可能與Se（Ⅵ）形態的變化有關。

表2 不同pH條件下烤煙根系吸收Se（Ⅵ）的動力學參數（n=4）Tab.2 Kinetic parameters of Se(Ⅵ)uptake by flue-cured tobacco roots at different pH values（n=4）

2.3 SO42-和PO43-對烤煙根系吸收Se（Ⅵ）動力學參數的影響

圖3 表明，隨著培養時間的增加，兩個烤煙品種根系的硒累積量亦趨于飽和。SO42-和PO43-對云煙87 和K326 兩個烤煙品種根系的硒累積量均有顯著抑制作用，其中SO42-對兩個烤煙品種根系硒累積量的抑制作用較大，分別為對照硒飽和累積量的21.7%和30.9%，說明SO42-顯著抑制烤煙對Se（Ⅵ）的吸收。這與Liu 等［24］在油菜上的研究結果一致。

圖3 SO42-和PO43-條件下烤煙根系硒累積量的動態變化Fig.3 Dynamic changes of Se accumulation in flue-cured tobacco roots under SO42-and PO43-conditions

表3 不同陪伴離子條件下烤煙根系吸收Se（Ⅵ）的動力學參數（n=4）Tab.3 Kinetic parameters of Se(Ⅵ)uptake by flue-cured tobacco roots under different ion conditions（n=4）

表3 表明，不同陪伴離子處理的兩個烤煙品種對Se（Ⅵ）的吸收存在顯著差異。K326 和云煙87烤煙的Imax值在SO42-存在時最低，比對照分別顯著降低72.50%和82.26%，說明SO42-存在時烤煙對Se（Ⅵ）的吸收速率最低。兩個烤煙品種的Km值和Cmin值在SO42-和PO43-存在時均顯著高于對照，尤以SO42-存在時K326 和云煙87 的Km值和Cmin值分別比對照提高78.81%和160.77%、408.66%和990.98%，說明在SO42-存在時烤煙根系對Se（Ⅵ）的親和力較弱，不利于烤煙根系吸收Se（Ⅵ）。除SO42-處理外，云煙87 的Imax值顯著高于同一陪伴離子條件下K326 的Imax值，這說明在SO42-和PO43-存在條件下，云煙87 比K326 對Se（Ⅵ）的吸收速率快。然而，在不同品種間SO42-存在條件下K326 和云煙87 的Km值和Cmin值無顯著差異，而PO43-存在時云煙87 的Km值和Cmin值比K326 分別顯著降低31.25%和51.18%，說明PO43-存在時云煙87 對Se（Ⅵ）的親和力相對較高。因此，在SO42-和PO43-存在條件下烤煙對Se（Ⅵ）的吸收有抑制作用，且以SO42-對烤煙Se（Ⅵ）吸收抑制性更強，這與黎妍妍等［17］的研究結果不同，PO43-對烤煙Se（Ⅳ）吸收抑制性更強?？赡苁怯捎诓煌瑑r態硒吸收轉運過程中的轉運蛋白不同造成的，硒酸鹽Se（Ⅵ）的化學性質與SO42-相近，且植物根系共用硫酸鹽轉運子運輸Se（Ⅵ）和SO42-，造成Se（Ⅵ）和SO42-在植物吸收過程中激烈競爭吸附位點，SO42-存在條件下抑制Se（Ⅵ）的吸收，而亞硒酸鹽Se（Ⅵ）的化學性質與PO43-相近，且植物根系共用磷酸鹽轉運子運輸Se（Ⅵ）和PO43-［25-27］。

2.4 CCCP 和LaCl3 對烤煙根系吸收Se（Ⅵ）動力學參數的影響

圖4 表明，隨處理時間的增加，兩個烤煙品種根系的硒累積量趨于飽和，呼吸抑制劑（CCCP）和通道抑制劑氯化鑭（LaCl3）的施用對云煙87 和K326 兩個烤煙品種根系的硒累積均有顯著抑制作用，且以CCCP 的抑制效果較大。這也證實了植物吸收硒酸鹽是以主動吸收為主的［28］。

圖4 CCCP 和LaCl3條件下烤煙根系硒累積量的動態變化Fig.4 Dynamic changes of Se accumulation in flue-cured tobacco roots under CCCP and LaCl3 conditions

不同抑制劑條件下烤煙根系吸收Se（Ⅵ）動力學參數見表4。兩種抑制劑處理的K326 和云煙87的Imax值均顯著低于對照，以CCCP 處理最低，僅為對照的17.51%和16.13%。與對照相比，在CCCP和LaCl3 處理K326 和云煙87 的Km和Cmin均顯著增加，且以CCCP 處理較高，說明使用外源CCCP 時烤煙對Se（Ⅵ）的親和力最弱，不利于烤煙吸收Se（Ⅵ）。CCCP 和LaCl3處理K326 的Imax均顯著低于云煙87，僅為云煙87 Imax的70.01%和68.18%，這說明抑制劑在兩個烤煙品種對Se（Ⅵ）吸收的抑制作用上K326 顯著高于云煙87。另外，抑制劑處理K326 的Km值和Cmin值均顯著高于云煙87，說明添加抑制劑對K326 對Se（Ⅵ）的親和力作用影響較大，而云煙87 對Se（Ⅵ）的吸收利用強于K326。本試驗中呼吸抑制劑CCCP 和通道抑制劑LaCl3的處理對云煙87 和K326 兩個烤煙品種Se（Ⅵ）的吸收有顯著抑制作用，以CCCP 對烤煙吸收Se（Ⅵ）的抑制性較大。這是因為硒酸鹽主要是通過主動吸收被植物根系吸收的［29-30］。

表4 不同抑制劑條件下烤煙根系吸收Se（Ⅵ）的動力學參數（n=4）Tab.4 Kinetics parameters of Se(Ⅵ)uptake by flue-cured tobacco roots at different inhibitor conditions（n=4）

3 結論

云煙87 和K326 對Se（Ⅵ）的吸收積累量和吸收動力學參數存在明顯差異，其中云煙87 屬于高Imax和低Km煙草品種，對Se（Ⅵ）的吸收積累及親和力優于K326，且對Se（Ⅵ）營養條件適應范圍較寬。在不同pH 條件下，pH 6 和pH 7 更有利于烤煙對Se（Ⅵ）的吸收積累；SO42-和PO43-存在條件下對烤煙Se（Ⅵ）的吸收積累和親和力有一定的抑制作用，且以SO42-對K326 和云煙87 的Se（Ⅵ）吸收抑制性更強；外源添加呼吸抑制劑CCCP 和通道抑制劑LaCl3可顯著抑制云煙87 和K326 對Se（Ⅵ）的吸收，以CCCP 的抑制作用較大。