腦膜敗血伊麗莎白菌耐藥性及同源性分析

劉 喆，王麗鳳，葉麗艷，沈定霞

解放軍總醫院第一醫學中心 醫學檢驗中心，北京 100853

腦膜敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica，EME)舊稱腦膜膿毒金黃桿菌，2005年Kim等[1]將其從金黃桿菌中分列出來，以首次發現者Elizabeth的名字命名為腦膜敗血伊麗莎白菌，歸至伊麗莎白菌屬。該菌廣泛存在于醫院的各種環境中。近年來，EME導致感染的病例有所增加。EME可以引起新生兒腦膜炎，在免疫力低下人群中可引起敗血癥、肺炎、心內膜炎等[2-3]。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，EME的耐藥菌株也在增多，且呈現較為廣泛的耐藥性。為幫助臨床合理選擇抗菌藥物，治療EME引起的感染，本研究對我中心分離的44株EME進行常用抗菌藥物的耐藥性和菌株之間同源性的分析，菌株之間相似性大多＜90%，差異較大，無明確相關性。

材料與方法

1 菌株來源 選取2012年4月- 2018年12月我中心臨床標本，按照同一患者相同來源菌株只計入第1次分離到的菌株的原則，獲得44株EME供本研究使用。質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、腸球菌ATCC29212。

2 儀器和試劑 35℃恒溫培養箱(Thermo公司)；VITEK MS(法國梅里埃公司)；血瓊脂平板、中國藍平板、M-H平板瓊脂平板為英國Oxoid公司產品；96孔藥敏板購自上海星佰生物技術有限公司，選取的抗菌藥物有哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、米諾環素(MH)、環丙沙星(CIP)、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(SXT)、萬古霉素(VA)、利奈唑胺(LZD)。

3 細菌的復蘇與鑒定 將臨床保存好的EME菌種在血平板上傳代1次，再用M-H瓊脂平板傳代2次，用質譜儀鑒定后備用[4-5]。

4 藥物敏感性實驗 采用微量肉湯稀釋法檢測12種抗菌藥物對44株EME的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)[6]，實驗中嚴格按照美國臨床實驗標準化協會(CLSI)的規則進行操作。菌液配制挑取菌落數個，置入2 ～ 3 ml滅菌0.9%氯化鈉注射液中，用0.5麥氏比濁管進行比濁，調制菌液濃度為1.5×108CFU/ml左右。取上述菌液60μl，滴入無菌加樣槽中，加營養肉湯液1支(12 ml)，混勻。用8通微量移液器，吸取稀釋菌液100μl，加入除陰性對照孔以外的微量藥敏板孔中，每孔中菌液含量為7.5×104CFU，陰性對照孔加100μl無菌營養肉湯液。將板條放入35℃培養箱培養24 h。自培養箱中取出板條，用干毛巾輕輕擦拭板條底部。肉眼判讀各個孔的結果，粉色結果顯示該孔有細菌生長，藍色為無細菌生長，記錄各種抗菌藥物抑制該菌生長的最低藥物濃度。除萬古霉素和利奈唑胺外，其余10種抗菌藥物按照CLSI關于非發酵菌抑菌圈標準進行敏感性的判讀。

5 同源性檢測 利用基質輔助激光解析離子-飛行時間質譜儀(MS)檢測44株EME的蛋白峰譜，并據此進行蛋白峰譜的差異比較。首先，用1μl定量接種環先將標準菌株大腸埃希菌ATCC8739均勻涂抹在質控位點的靶板上，然后加1μl的VITEK MS-CHCA基質液，待檢的純培養細菌涂板方法與質控菌株一致，等待靶板自然干燥后放入MS質譜儀器進行檢測，然后儀器會自動將所得菌的蛋白質峰圖與數據庫中峰圖進行比較，分析得出鑒定結果。

6 同源性分析方法 質譜儀通過自帶軟件Saramis獲得細菌的蛋白質峰圖信息，并將蛋白質峰圖信息導入軟件，進行各個峰圖的成份分析及聚類分析，從而對細菌進行分型，分析菌株之間的同源性。菌株相似性＜90%為無同源性。

結 果

1 標本來源分布 標本采集自患者下呼吸道36例(81.7%)、血液2例(4.5%)、尿液1例(2.3%)和拭子1例(2.3%)，其次來自穿刺液、腹水、膿液、膽汁各1例(分別占2.3%)，共獲得44株EME。其中男性患者34例，女性患者10例，多數患者伴有基礎疾病，如高血壓、糖尿病、腎病、車禍傷、腦外傷、慢阻肺、惡性腫瘤等。EME在我中心分布范圍較廣，多個病區均分離出該菌，其中最多的為各科室的ICU病房(43.2%)，其次為呼吸科和急診科，分別占18.1%和13.6%。44株EME的科室分布見表1。

表1 腦膜敗血伊麗莎白菌檢出的科室分布Tab.1 Distribution of detection of Elizabethkingia meningoseptica bacteria in meningeal septicemia

2 藥敏試驗結果 萬古霉素和利奈唑胺對金黃色葡萄球菌ATCC29213和腸球菌ATCC29212的MIC值在質控范圍內，除萬古霉素和利奈唑胺外其余10種抗菌藥物對大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853的MIC值也在質控范圍內。臨床菌株藥敏試驗結果：EME對頭孢菌素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類和磺胺類抗菌藥物均有很高的耐藥性，呈現出多重耐藥，除了亞胺培南外其余藥物耐藥率均高于80%，而對頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素的耐藥率達到100%。對含酶抑制劑類抗菌藥物哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率達到63.6%。該菌對米諾環素的耐藥率為0，敏感率達到100%。個別菌株對復方新諾明敏感，大部分菌株對復方新諾明中度耐藥，幾乎所有菌株對碳青霉烯類(亞胺培南，美羅培南)、酶抑制劑類(哌拉西林/他唑巴坦)、頭孢類、氨基糖苷類(慶大霉素，阿米卡星)、喹諾酮類(環丙沙星)高度耐藥。見表2(中介指的是處于敏感和耐藥之間)。

3 萬古霉素和利奈唑胺的藥敏實驗結果 萬古霉素和利奈唑胺對EME的MIC值均≥8μg/ml，其中萬古霉素的MIC值集中在8 ～ 64μg/ml，≥128μg/ml各有1株菌，而利奈唑胺對EME菌的MIC值≥16μg/ml超過97%以上。見表3。

4 同源性分析 44株EME質譜同源性結果顯示各菌株相似的百分比多數＜90%，菌株的采集時間和各科室分布均較分散，提示菌株之間無明確相關性。見圖1。

圖 1 44株EME質譜同源性分析Fig.1 Homology analysis by mass spectrometer of 44 strains of Elizabethkingia meningoseptica

表2 10種抗菌藥物對44株EME細菌藥敏試驗結果Tab.2 Drug sensitivity test results of 44 strains of Elizabethkingia meningoseptica to 12 kinds of drugs (n,%)

表3 萬古霉素和利奈唑胺對EME不同MIC值的菌株數Tab.3 Different minimum inhibitory concentration of Elizabethkingia meningoseptica to vancomycin and linezolid

討 論

腦膜敗血伊麗莎白菌是一種非發酵的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于水和土壤環境中。該菌無芽孢、無鞭毛、無動力，在血平板、中國藍平板和MH平板上均可生長，其中在血平板上37℃培養24 h后，會形成白色或黃色菌落，呈圓形且邊緣整齊[7]。該菌在醫院很多處存在，如水槽、水龍頭、吸痰器、鼻導管、氧氣瓶等。近年來，關于該菌引起的新生兒和早產兒感染、免疫力低下成年人醫院獲得性肺炎的報道屢見不鮮。目前，該菌已被認為是醫院感染常見的條件致病菌之一。本研究結果顯示，44株EME主要來自下呼吸道標本(占81.7%)，其余血、尿等一些無菌體液標本均較少(占18.3%)，與寧興旺等[8]報道的EME主要引起病人下呼吸道感染基本一致。另外，44株EME感染患者主要來自腎病科、神經科等6個科室的ICU病房，其次來自呼吸科和急診科，分別占43.2%、18.1%和13.6%。分析原因，與ICU病房患者大多合并基礎疾病，健康營養條件差，呼吸科患者大量使用呼吸機、吸痰器以及急診科患者多有腦外傷、車禍傷、手術創傷等有關[9]。且這些患者多數接受各種侵入性檢查，如靜脈插管、機械通氣等，EME通過傷口進入機體從而引起感染[10]。加強醫院環境定期消毒，加強介入性醫療操作無菌規范是有效預防EME引起醫院感染的重要途徑。

EME具有多重耐藥性，尤其對用于治療革蘭陰性桿菌感染的抗菌藥物，如頭孢類、氨基糖苷類以及碳青霉烯類[8,11-15]。本研究藥敏結果顯示44株EME對阿米卡星、環丙沙星、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶和美羅培南耐藥率均高于80%，對頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素的耐藥率高達100%。這與寧興旺等[8]報道結果一致。因此，臨床治療時避免使用此類抗菌藥物。而對含酶抑制劑類抗菌藥物哌拉西林/他唑巴坦的耐藥性也達到了63.6%，這與殷麗軍等[11]報道的差異較大。可能是由于我中心感染患者來自ICU病房較多，已經廣泛使用抗菌藥物進行治療，導致菌株多重耐藥有關。另外，EME對米諾環素有較好的抗菌活性，敏感率達到100%，因此，米諾環素可作為經驗治療EME感染首選藥物。

多項報道提示萬古霉素和利奈唑胺對EME有較好的抗菌活性[16-18]。但本次研究藥敏試驗結果顯示兩者MIC值均較高，由于CLSI并沒有關于萬古霉素和利奈唑胺對EME的折點范圍，因此建議謹慎選用這兩種藥物治療EME所致的感染。

于濤等[18]曾報到利用PFGE對EME進行分型，發現ICU治療室臺面和該科護士的手有相同的PFGE圖譜，表明受污染的物體表面與醫護人員的手會造成EME傳播。對菌株進行同源性分析有許多方法，如PFGE、測序等。這兩種方法分辨率較高，可以更精準地對菌株進行同源性分析。本文中采用質譜儀對菌株進行同源性分析雖然相對粗糙，但該方法簡單、快速，而且質譜儀是臨床實驗室常用設備，且該儀器本身的數據庫支持同源性分析，因此該方法可作為臨床初步判定菌株間傳播流行的依據。本研究利用質譜儀對44株EME進行初步同源性分析，結果顯示從采集時間和科室分布來看，各菌株相似程度較低，即各株EME之間無明確相關性，說明EME在我中心各科室間沒有引起傳播流行。