人參皂苷Rg1對輻射致腸IEC-6細(xì)胞損傷保護(hù)作用的體外實驗

王毓國，竇永起，趙 森

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 中醫(yī)科，北京 100853

放射性腸損傷是腫瘤放射治療的常見并發(fā)癥，有研究表明在腹部、盆腔放療中，60%以上患者出現(xiàn)腹痛、惡心、腹脹、便血等放射性腸損傷的早期癥狀，而放射性腸損傷后期可能會出現(xiàn)腸梗阻，甚至腸穿孔[1-2]。因此，放射性腸損傷的發(fā)生降低了腫瘤治愈率。目前，該病的發(fā)生機(jī)制已基本明確：一方面，放射線的直接殺傷作用可引起快速增殖的腸上皮細(xì)胞死亡；另一方面，細(xì)胞內(nèi)活性氧類增加，核DNA損傷，引發(fā)細(xì)胞凋亡。兩方面均導(dǎo)致腸上皮更新速度減緩，腸道屏障破壞[3-4]。近年來，手術(shù)、氨磷汀注射、抗生素、高壓氧等多種治療方式雖然取得了一些效果，但存在作用范圍小、不良反應(yīng)多等缺陷[5]。而越來越多的臨床研究表明，中醫(yī)藥能夠有效減輕患者的消化道反應(yīng)，提高生存質(zhì)量，且本團(tuán)隊前期證實了益氣涼血解毒中藥能夠有效減輕大鼠放射性腸損傷，抑制炎癥反應(yīng)[6-8]。人參皂苷Rg1是人參中的主要成分之一，研究證實其可有效改善輻射導(dǎo)致的皮膚損傷、神經(jīng)損傷，但Rg1對腸細(xì)胞輻射損傷的治療研究卻鮮有報道[9-10]。因此，本實驗擬探討Rg1對輻射致IEC-6細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探索其作用機(jī)制。

材料和方法

1 實驗材料與儀器 細(xì)胞系：選擇大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell No.6，IEC-6)，購自國家實驗細(xì)胞資源共享平臺。實驗用試劑：人參皂苷Rg1(貨號：E035580)、LY294002(貨號：F035850)均購自上海一飛生物科技有限公司；胎牛血清(貨號：FSP500)、PBS(貨號：C10010500bt)購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；胰酶(貨號：25200-072)購自賽默飛世爾科技有限公司公司；DMEM培養(yǎng)液(貨號：26418007)購自康寧公司；CCK-8試劑(貨號：CK04)購自東仁化學(xué)科技有限公司；裂解液(貨號：Cat.#1610747)購自伯樂公司；凋亡試劑盒(貨號：E-CK-A211)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；p-AKT抗體(貨號：BSM-52131R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Bax抗體(貨號：ab32503)購自艾博抗公司；Bcl-2抗體(貨號：ab59348)購自艾博抗公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒(貨號：G2003)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。儀器：60Co-γ照射裝置(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院)；CO2培養(yǎng)箱：賽默飛HEPA dass100；潔凈工作臺：中國冠鵬900；高速離心機(jī)：長沙TDZ5-WS；酶標(biāo)儀：賽默飛2030-0050；流式細(xì)胞儀：碧迪Calibur。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 大鼠IEC-6細(xì)胞于含有5% FBS和0.01 mg/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2、飽和濕度，匯合度達(dá)80%時傳代培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行照射，照射源由軍事醫(yī)學(xué)研究院提供，照射劑量為4 Gy，距離4 m。實驗分為空白組(Control)、模型組(Model)、中藥組(Rg1)及中藥+抑制劑組(Rg1+LY294002)。

3 CCK8法測定細(xì)胞活力 消化生長狀態(tài)良好的IEC-6細(xì)胞，進(jìn)行計數(shù)后，以2×103/ml的細(xì)胞密度接種于96孔板上(200μl/孔)，中藥組加入10μmol/L的人參皂苷Rg1，中藥+抑制劑組加入同等濃度Rg1外，再滴加10μmol/L的LY294002。隨后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于照射后12 h、24 h、36 h，每孔加入100μl含10% CCK-8的培養(yǎng)基孵育1 h，使用酶標(biāo)分析儀測量各孔光密度值。

4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢定IEC-6細(xì)胞的生存率及凋亡率 將細(xì)胞以4×105/孔接種于六孔板，各組藥物干預(yù)處理同CCK-8，依照Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒說明，對照射后12 h、24 h、36 h細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測。先用0.25%胰酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管進(jìn)行離心(1 000 r/min，5 min)。棄上清，用PBS重懸細(xì)胞，再次離心1次，棄上清，用100μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μl的Annexin-V和5μl的PI混勻后，避光反應(yīng)20 min，使用流式細(xì)胞儀檢測生存率和凋亡率。

5 Western blot法測定細(xì)胞p-AKT、Bcl-2、Bax表達(dá) 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜、常溫封閉、孵育、一抗4℃過夜、二抗室溫結(jié)合、漂洗等操作后，采用圖像分析軟件Adobe PhotoShop分析結(jié)果，檢測各組p-AKT、Bcl-2、Bax相對表達(dá)水平。

6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以-x±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊的細(xì)胞活性及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)實驗結(jié)果的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，其余數(shù)據(jù)方差不齊，兩兩比較采用Tamhane檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人參皂苷Rg1對輻射后IEC-6細(xì)胞增殖活力的影響 CCK-8結(jié)果表明，照射后12 h、24 h、36 h各照射組細(xì)胞增殖活力較空白組均出現(xiàn)下降趨勢，其中12 h時模型組(0.47±0.01)及中藥+抑制劑組(0.47±0.02)細(xì)胞增殖活力明顯低于空白組(0.51±0.02，P＜0.05)，且中藥組(0.51±0.01)高于模型組及中藥+抑制劑組(P＜0.05)；24 h時中藥組(0.52±0.01)仍高于模型組(0.47±0.01，P＜0.05)及中藥+抑制劑組(0.47±0.01，P＜0.05)。見圖1。

圖 1 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6細(xì)胞活力比較(n=9； aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.1 Comparison of activity of IEC-6 cells at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9;aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

圖 2 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6細(xì)胞生存和凋亡的流式細(xì)胞圖(n=9)Fig.2 Flow cytometry of survival and apoptosis of IEC-6 cells in each group at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9)

2 人參皂苷Rg1對輻射后IEC-6細(xì)胞存活率和凋亡率的影響 照射后12 h：與空白組比較，模型組及中藥+抑制劑組IEC-6細(xì)胞存活率明顯降低(P＜0.05)，凋亡率顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，中藥組細(xì)胞存活率升高(5.53%±4.14% vs 78.89%±6.89%，P＜0.05)，凋亡率降低(73.39%±16.46% vs 12.14%±3.02%，P＜0.05)；且中藥組存活率高于中藥+抑制劑組(78.89%±6.89% vs 5.67%±3.91%，P＜0.05)，凋亡率低于中藥+抑制劑組(12.14%±3.02% vs 90.26%±5.41%，P＜0.05)。照射后24 h：模型組及中藥+抑制劑組存活率低于空白組(P＜0.05)，中藥組存活率高于中藥+抑制劑組(P＜0.05)；中藥+抑制劑組凋亡率高于空白組和模型組(P＜0.05)，中藥組凋亡率低于中藥+抑制劑組(P＜0.05)。照射后36 h：模型組、中藥組細(xì)胞存活率較空白組相當(dāng)(P＞0.05)，而中藥+抑制劑組仍低于空白組(P＜0.05)，凋亡率均高于其他組(P＜0.05)，見圖2 ～ 圖4。

圖 3 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6細(xì)胞存活率變化(n=9) (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.3 Changes of survival rate of IEC-6 cells at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9) (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

圖 4 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6細(xì)胞凋亡率變化(n=9； aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.4 Changes of apoptotic rate of IEC-6 cells in each group after irradiation (n=9;aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

圖 5 各組IEC-6細(xì)胞p-AKT、Bcl-2及Bax表達(dá)情況(n=9) A:p-AKT表達(dá)； B:Bcl-2表達(dá)； C:Bax表達(dá)； D:Bax/Bcl-2比值(aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.5 Expression of p-AKT,Bax and Bcl-2 in IEC-6 cells of each group (n=9) A:p-AKT expression;B:Bcl-2 expression;C:Bax expression;D:Bax/Bcl-2 ratio (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

3 人參皂苷Rg1對輻射12 h時IEC-6細(xì)胞p-AKT、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 統(tǒng)計分析結(jié)果表明：各組p-AKT相對表達(dá)量比較，模型組及中藥+抑制劑組較空白組明顯下降(P＜0.05)，與模型組比較，中藥組升高(0.49±0.07 vs 0.66±0.07，P＜0.05)，中藥+抑制劑組降低(P＜0.05)；各組Bax和Bax/Bcl-2相對表達(dá)量比較，模型組、中藥+抑制劑組Bax和Bax/Bcl-2均高于空白組(P＜0.05)，中藥組Bax低于模型組(0.11±0.03 vs 0.28±0.04，P＜0.05)，中藥組Bax/Bcl-2低于模型組(0.39±0.11 vs 2.54±0.71，P＜0.05)，中藥組Bax和Bax/Bcl-2均低于中藥+抑制劑組(P＜0.05)；Bcl-2相對表達(dá)量比較，各照射組均低于空白組(P＜0.05)，中藥組較模型組升高(0.30±0.03 vs 0.12±0.04，P＜0.05)，且高于中藥+抑制劑組(P＜0.05)。見圖5。

討 論

放射性腸損傷是放療的主要并發(fā)癥，給患者帶來較大痛苦，一直缺乏有效的治療手段及藥物。IEC-6細(xì)胞是取自健康大鼠空腸隱窩部位，并在體外培養(yǎng)成的細(xì)胞系，能較好地體現(xiàn)腸上皮細(xì)胞的生物特性，是放射性腸損傷研究中的經(jīng)典細(xì)胞類型[12]。有研究表明，人參單體及多種有效成分均具有輻射防治作用，如人參可通過阻斷ROS的產(chǎn)生，抑制Caspase、p38等通路來保護(hù)細(xì)胞[13]；人參皂苷Rg1能夠增強(qiáng)小鼠造血干/祖細(xì)胞對輻射衰老的抵抗力[14]，還能夠通過Nrf2/HDAC2信號減弱射線誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素抵抗[15]；人參多糖可調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)，對小鼠腸輻射損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[16]。但Rg1對輻射所致腸IEC-6損傷的治療研究極少。有動物實驗表明，Rg1是人參中抑制腸隱窩細(xì)胞凋亡的最有效成分之一。本團(tuán)隊研究表明，益氣涼血中藥能夠有效延緩病情發(fā)展，延長大鼠生存期。因此，本實驗擬證實Rg1對輻射致腸IEC-6細(xì)胞凋亡的抑制作用。

PI3K/AKT是一條經(jīng)典的促生存和抗凋亡通路，其中PI3K具有蛋白激酶活性，可產(chǎn)生胞內(nèi)信使PIP3，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、代謝[17-18]。PIP3可以與AKT結(jié)合，產(chǎn)生磷酸化的p-AKT，激活下游靶點Bcl-2。Bcl-2蛋白可直接調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，調(diào)節(jié)凋亡因子的釋放，而Bax的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2與Bax是一對凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2可以和Bax形成二聚體，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生存、抑制凋亡[19]。LY294002是PI3K的典型抑制劑，可靶向地抑制PI3K催化亞基p110的作用，進(jìn)而抑制p-AKT的表達(dá)及下游因子的活化[20]。

本實驗研究表明，IEC-6細(xì)胞在遭受輻射后，細(xì)胞活力下降，照射后12 h，模型組細(xì)胞存活率下降明顯，中藥組存活率明顯高于模型組，表明人參皂苷Rg1能夠有效促進(jìn)照射后的IEC-6細(xì)胞恢復(fù)及生長，而同時應(yīng)用IP3K抑制劑LY294002后，存活率顯著下降。生存率及凋亡率比較顯示，照射后細(xì)胞出現(xiàn)存活率下降、凋亡率升高的趨勢，以模型組和中藥+抑制劑組最明顯，而人參皂苷Rg1能夠有效促進(jìn)細(xì)胞生存、減少凋亡發(fā)生，至照射后36 h，各照射組細(xì)胞狀態(tài)逐漸恢復(fù)。課題組進(jìn)一步選擇細(xì)胞存亡組間差異最為顯著的12 h行蛋白印跡檢測，其結(jié)果提示人參皂苷Rg1有效促進(jìn)p-AKT、Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax表達(dá)。結(jié)合中藥+抑制劑組蛋白表達(dá)情況，我們認(rèn)為人參皂苷Rg1是通過促進(jìn)PI3K/AKT的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到抑制IEC-6細(xì)胞凋亡，促進(jìn)存活，并保持其良好的增殖活性。

本實驗闡釋了人參皂苷Rg1對于放射線所致腸IEC-6細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，為本病的臨床治療提供新的思路，為研制放射性腸損傷特效藥奠定實驗基礎(chǔ)。