重型/危重型新型冠狀病毒肺炎患者多種生物樣本核酸檢測結果分析

吳建國，羅建飛，劉家盛，劉 丹，鄧 俊，錢志成，胡利萍，李士軍，肖 喆，王旭峰，彭志洋，閆瑞承1武漢大學人民醫院 東院感染性疾病五病區，湖北武漢 000；武漢大學人民醫院 東院胃腸外科，湖北武漢 000；四川大學華西醫院 呼吸科，四川成都 10000；西南醫科大學附屬醫院 呼吸科，四川瀘州 000；川北醫學院附屬醫院 重癥醫學科，四川南充 7000；新疆醫科大學第一附屬醫院 感染科，新疆烏魯木齊 80001

2019冠狀病毒病(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一種由新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染導致的急性重癥肺炎，自2019年12月以來，在湖北省武漢市陸續發現，并隨后向全國蔓延，世界部分地區也呈現暴發趨勢[1-2]。COVID-19主要通過呼吸道飛沫和密切接觸傳播，也存在經氣溶膠傳播的可能[3]。鐘南山院士團隊發現部分患者的糞便及尿液樣本中2019-nCoV核酸檢測呈陽性并成功分離出活的2019-nCoV[4-5]。提示2019-nCoV也有可能通過糞-口傳播。實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)和病毒基因測序為診斷COVID-19金標準，目前主要采集鼻咽拭子樣本進行檢測。本研究擬利用實時熒光定量RT-PCR方法檢測確診患者不同類型生物樣本，闡述2019-nCoV在人體內不同系統、不同階段的分布特點及其臨床意義。

對象與方法

1 研究對象 納入2020年1月31日- 2020年2月19日武漢大學人民醫院東院(武漢市危重癥COVID-19定點收治醫院)感染性疾病五病區收治的重型/危重型COVID-19確診患者共19例。COVID-19診斷標準：依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》，符合相關流行病學、臨床表現，鼻咽拭子實時熒光RT-PCR檢測2019-nCoV核酸陽性，COVID-19病例分型為重型和危重型[3]。

2 生物樣本采集 本研究納入病例入院時鼻咽拭子2019-nCoV核酸均為陽性。入院治療兩周后由主管醫生在三級防護條件下，在隔離病房采集COVID-19病例的鼻咽拭子、痰液、血液、糞便、肛門拭子樣本作為復查。

3 試劑和儀器 采用華大基因生產的2019-nCoV核酸檢測試劑盒及核酸提取試劑盒。核酸提取采用DA3200核酸提取儀，產物擴增采用ABI7500型PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific)。

4 核酸提取及產物擴增 采用磁珠法提取核酸，試劑盒含磁珠結合液、磁珠洗滌液、洗脫液及蛋白酶K。根據中國疾病預防控制中心推薦選用針對2019-nCoV病毒的ORF1ab和核殼蛋白N基因區域的引物和探針。

5 結果判定 首先分析內標在HEX通道是否有擴增曲線，且擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環數(cycle threshold，Ct)。若內標在HEX通道檢測到Ct或Ct≤40，則表示本次檢測有效，可繼續進行后續分析：1)若FAM或ROX通道檢測到典型的S型擴增曲線，且Ct≤40，則判定該結果為2019-nCoV核酸檢測為陽性；2)若FAM及ROX通道均未檢測到典型的S型擴增曲線(未檢測到Ct)，或Ct＞40，則表示2019-nCoV核酸檢測為陰性；3)若內標在HEX通道沒有檢測到Ct或Ct＞40，則表示本次檢測樣本濃度太低或者有干擾物質抑制反應，需重新實驗。

6 統計學方法 一般統計學描述。

結 果

1 納入患者一般情況 納入19例確診的重型/危重型COVID-19，其中男10例，女9例；平均年齡67(51 ～86)歲；根據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》評估分型，重型17例，危重型2例。

2 不同樣本核酸檢測陽性率 19例COVID-19確診病例治療兩周后接受不同生物樣本的2019-nCoV核酸檢測，結果如下：復查鼻咽拭子核酸檢測陽性率42.10%(8/19)，痰液核酸檢測陽性率68.42%(13/19)，血液核酸檢測陽性率5.26%(1/19)，糞核酸檢測陽性率21.05%(4/19)，肛拭子核酸檢測陽性率10.52%(2/19)。多樣本陽性患者病情較重，且轉歸較差(病例2，病例8)。多樣本陰性患者(病例4，病例15)癥狀緩解。見表1。

討 論

2019-nCoV病毒核酸檢測陽性是COVID-19病例的病原學確診依據，目前多采用上呼吸道鼻咽拭子作為核酸檢測樣本，而其他生物樣本行臨床報告較少。本研究發現，復查鼻咽拭子2019-nCoV核酸檢測陽性率42.10%(8/19)，同時檢測到痰液2019-nCoV核酸檢測陽性率68.42%(13/19)。在重型/危重型COVID-19患者中，呼吸道2019-nCoV核酸檢測陽性率較高，其中下呼吸道痰液2019-nCoV核酸檢測陽性率明顯高于上呼吸道鼻咽拭子。有相關文獻報道2019-nCoV主要是通過S1-蛋白與人肺部ACE2受體結合侵入人體細胞，在肺部高表達ACE2的細胞83%是Ⅱ型肺泡上皮細胞(AT2)[6-9]。而Ⅱ型肺泡上皮細胞主要分布在下呼吸道，這與COVID-19臨床上以下呼吸道癥狀為主相符合。由此我們推測下呼吸道可能是2019-nCoV的主要靶器官。臨床工作中肺泡灌洗液標本因采集難度大、增加采集者感染風險，通常不建議常規使用(氣管切開、呼吸機輔助呼吸病例除外)。因此我們建議同時檢測鼻咽拭子和痰液核酸檢測以提高準確率，減少假陰性率。

表1 19例治療2周后不同類型生物樣本的2019-nCoV核酸檢出結果Tab.1 2019-nCoV detection results in 19 severe/critically ill patients from different specimens after two-week treatment

本研究同時發現糞便2019-nCoV核酸檢測陽性率21.05%(4/19)，肛門拭子核酸檢測陽性率10.52%(2/19)，提示COVID-19有糞-口傳播可能。ACE2不僅在肺細胞，而且在消化道上皮細胞中也高表達，提示消化道也可能是2019-nCoV感染的潛在靶器官，消化道核酸檢測值得關注[10-11]。在臨床治療過程中，我們發現患者的消化道癥狀比較罕見，而糞便/肛拭子陽性患者，其痰液陽性率亦較高，可能為2019-nCoV經呼吸道分泌物吞進消化道所致，但也不排除消化道黏膜屏障損傷導致。因此2019-nCoV是否侵入消化道需要進一步深入研究。本研究發現部分COVID-19病例呼吸道(鼻咽拭子/痰液)核酸檢測陰性而消化道核酸(糞/肛拭子)檢測卻呈陽性，提示消化道2019-nCoV清除時間較呼吸道延遲，而目前根據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》單純兩次連續(采樣時間間隔至少1 d)呼吸道核酸檢測陰性作為出院標準[3]。患者假陰性出院和出院后復陽的風險較高，因此是否將消化道(糞便/肛門拭子)核酸檢測納入出院標準值得探討，對患者出院后嚴格的隔離及復查有一定的參考意義。

本研究還發現1例COVID-19患者血液樣本2019-nCoV核酸檢測陽性。血液中存在活性病毒或病毒核酸片段都有可能導致核酸檢測陽性，但目前尚未見到血液中分離出2019-nCoV的報道，血液是否具有傳染性有待進一步研究。本研究發現兩例危重型患者多樣本2019-nCoV核酸檢測均呈陽性，并且后期病情轉歸較差，其原因可能是病毒滴度較大，多器官受累導致；而兩例多樣本核酸檢測均呈陰性COVID-19患者，其癥狀緩解及肺部炎癥滲出吸收較為理想，提示COVID-19患者多樣本核酸檢測陽性率可能與患者病情程度有關。

綜上所述，本研究發現重型/危重型COVID-19病例呼吸道病毒核酸檢測陽性率較高，其中痰液檢測陽性率高于鼻咽拭子，呼吸道2019-nCoV轉陰的病例其消化道2019-nCoV檢測仍存在一定陽性率，血液是否具有傳染性有待進一步研究。進行多種生物樣本病毒核酸檢測能提高2019-nCoV檢出率、降低出院病例假陰性率。