抗體檢測(免疫層析法)用于新型冠狀病毒肺炎的輔助診斷及影響因素

郜振國，李 方，黃 佳，陳 媛，馬合木提

自2020年1月以來，我們對新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疾病臨床表現等各個方面的認識逐漸加深[1-2]，同時隨著新型冠狀病毒肺炎防控、診斷、治療經驗的積累，越來越多的檢測方法進入我們的視野，也給我們提供了越來越多的技術手段和方法來追蹤和監測新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例。隨著疾病的發展，不管是確診病例還是無癥狀感染者都會在體內產生抗體，《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第五版)》和《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中都提到了抗體的檢測，且逐步將抗體檢測納入了我們疾病診斷的范疇[3-4]。

新型冠狀病毒抗體檢測試劑(免疫層析法)的出現讓我們對于新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例的發現和診斷又提供了一種實驗室技術手段和方法。盡管免疫層析法檢測試劑不能單獨作為新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例確診和排除的依據，但是由于其檢測方法簡便、快速，其在用于臨床新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)感染者初篩方面還是具有一定的意義，可以作為臨床、流行病學及核酸檢測方法的補充。為了了解在實際應用過程中該方法的靈敏度、特異度及實際工作過程中哪些因素會影響檢測結果陽性率。我們選擇該試劑進行了應用方面的測試和研究。

1 材料與方法

1.1對象 共收集來自于不同人群的84例血清學標本進行抗體檢測情況的研究。其中病例組為21例新型冠狀病毒(COVID-19)確診病例的血清標本，同時收集病例組患者咽拭子進行實時熒光定量PCR檢測進行比對。確診依據新型冠狀病毒防控方案及診療方案。其余63例為對照組，其中包含2020年非病例血清標本13例，2016-2019年禽流感職業暴露人群血清標本50例。

1.2實驗試劑 廣州萬孚生物技術股份有限公司生產的《新型冠狀病毒抗體檢測試劑(免疫層析法)》試劑盒，病例組和對照組血清標本，百世諾核酸提取試劑，上海伯杰2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(雙重熒光PCR法)。

1.3血清學檢測方法 試驗所使用試劑適用于檢測人血清、血漿、靜脈全血中的新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體(總抗體，包括IgG和IgM)。待測樣本、檢測試劑及其他材料平衡至室溫，使用移液槍吸取10 μL血清樣本加入測試卡小孔中，向測試卡大孔加入樣本稀釋液80 μL。靜置15 min后觀察實驗結果。判斷標準：被檢測區(T)二抗(抗μ鏈抗體/抗人IgG抗體)形成紅色反應線，此時結果判為陽性；反之不顯帶結果判為陰性。

1.4核酸提取及檢測方法 核酸提取過程使用自動核酸提取儀西安天隆公司生產的NP968進行，使用百世諾預封裝核酸提取試劑盒，提取過程參見試劑盒說明書。使用上海伯杰公司生產的2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒進行核酸檢測，反應體系配制方法為：每個體系加入qRT-PCR反應液12 μL，酶混合液4 μL，引物探針4 μL，加入模板5 μL，總體系25 μL。擴增反應溫度為：50 ℃,10 min，1循環；95 ℃，5 min，1循環；95 ℃ 10 s，55 ℃，40 s，40循環。結果判定：擴增曲線呈S型，且Ct值≤35，為陽性；Ct值>38或未檢出，為陰性；擴增曲線呈S型，且35

1.5數據分析 數據的分析使用Excel 2003及SPSS 22.0軟件進行整理及統計學處理。其中非正態分布資料使用非參數檢驗方法中的MannyWhitney方法分析；滿足正態性及方差齊性的資料使用t檢驗進行統計學分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值 我們共納入了84例來自不同人群的血清標本進行檢測，具體情況詳見表1。共選擇的21例核酸檢測陽性的確診病例血清樣本中，陽性檢出15例，其靈敏度為71.43%；選擇的非病例共63例，其中準確檢測為陰性者為62例，特異度為98.41%。綜合判定來看，其臨床診斷準確率為91.67%；使用該種試劑進行檢測的陽性預測值為93.75%，陰性預測值為91.18%。

表1 新型冠狀病毒抗體檢測試劑(免疫層析法)檢測結果
Tab.1 Results of 2019-nCov antibody detection reagent

抗體檢測結果確診病例非病例合計陽性15116陰性66268合計216384

2.2病例血清學樣本的采集時間對檢測結果的影響 為了解采樣時間對陽性檢出是否有差異和影響，我們詳細記錄了每一例確診病例有明確癥狀時間開始到樣本采集時間進行檢測結果的分析(見表2)。21例確診病例的血清采集介于病例發病后的第1 d至第18 d。其中能夠檢出陽性的采集時間介于3～18 d，平均采集時間7.7 d。無法檢出陽性的血清采集時間介于1～6 d，平均采集時間2.5 d，Wilcoxon W=33.5，P=0.011<0.05，差異具有統計學意義，所以采樣時間的先后對于該試劑的陽性檢出具有影響，樣本采集時間過早陽性檢出率降低。

圖1 確診病例中抗體檢測陽性組與檢測陰性組的采集時間比較Fig.1 Comparison of the collection time of the positive antibody test group and the negative test group in the confirmed cases

2.3發病后第1 d咽拭子病毒載量對于檢測結果的影響 對于所納入該研究的所有確診病例發病后的第1 d我們都及時采集了咽拭子標本并使用統一的核酸提取試劑和核酸檢測試劑進行了實時熒光定量PCR方法的檢測。同時檢測了ORF1a/b基因和N基因并記錄了檢測Ct(Cycle threshold)值(見表3)。由于我們所使用的核酸提取試劑和核酸檢測試劑相同，并使用實時熒光定量PCR的檢測方法，所以其Ct值的高低可以反映病例發病后早期的咽部病毒載量。ORF1a/b以及N基因的兩組Ct值數據均滿足正態分布及方差齊性，ORF1a/b基因檢驗結果t=1.390，P=0.181>0.05；N基因檢驗后得到t=-0.066，P=0.948>0.05。這兩個基因的檢測結果都顯示出早期咽部病毒載量并不是影響抗體檢出差異的因素。

3 討 論

在早期的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)防控方案中，并未提到抗體檢測的方法，更多的是采用病毒核酸檢測和病毒基因組測序的方法進行新型冠狀病毒肺炎病例(COVID-19)的實驗室檢測。在實際應用中，由于核酸檢測會受到咽拭子標本采集準確性及病毒清除的影響，存在一定的假陰性[5-6]。但是抗體在機體內所存在的時間較長且在相當一段時間內具有穩定性，所以測定血清中抗體的方法就會為核酸檢測的方法提供很好的補充。同時，由于核酸檢測的方法所需要的儀器耗材等條件比較高，耗費時間相較抗體檢測試劑(免疫層析法)更長，所以其在一定時間內所檢測的樣本量有限。

表2 確診病例中抗體檢測陽性組與陰性組中咽拭子核酸檢測Ct值比較
Tab.2 Comparison of Ct values in the throat swab nucleic acid test between positive groups and negative groups

樣本編號Ct值抗體陽性組抗體陰性組ORF1a/bNORF1a/bNXJ-001～XJ-02128.6126.3728.8927.5934.934.5932.425.4429.0828.1333.7931.3327.2328.0533.2229.2328.3331.3334.3329.3231.7530.9431.5334.0125.3324.3725.0123.3923.1422.1332.4932.5834.8433.3734.3130.2328.3829.3831.3232.3334.3133.37

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例的抗體檢測并不是只有免疫層析法這一種方法，化學發光法也是很好的選擇，但其同樣存在著需要大型檢測儀器，檢測方法較繁瑣、耗費的檢測時間較長等缺點。而新型冠狀病毒抗體檢測試劑(免疫層析法)操作簡便快捷，時間短，可以在相同時間內篩檢更多的病例，但是由于免疫層析法抗體檢測試劑靈敏度和特異度無法達到100%，所以這對其應用帶來了很大的限制，評估其靈敏度和特異度對于提出其作為診斷的補充檢測方法具有很大的作用和意義。

膠體金抗體檢測方法的靈敏度和特異度是診斷的主要影響因素之一。為了更好的了解該種試劑在實際應用中的情況，我們選擇了84例標本進行檢測。經檢測，該試劑的靈敏度為71.43%，特異度為98.41%，通過本次結果可以發現，該試劑的特異度較高，靈敏度欠佳。也就表明使用該試劑進行檢測存在一定的漏檢可能性，同時也存在著一定的假陽性情況，并且漏檢可能性相較于假陽性的比率高。同化學發光法相比較，其靈敏度和特異度均較化學發光法低(靈敏度96%，特異度100%)[7]。

通過本次研究可以發現，病例從發病到血清學樣本采集的時間對抗體的陽性檢出率有影響。病毒感染早期產生IgM抗體，晚期大量產生IgG抗體，由于我們所研究的試劑包被了兩種抗原，所以IgM和IgG均能檢出，其中任意一項陽性或者兩者都陽性均記錄為陽性檢出，所測定的抗體為患者機體產生的總抗體，采樣時間對抗體陽性檢出率有影響的結論適用于總抗體檢測的情況。本次研究的血清學標本采集時間介于確診病例出現明確癥狀后的第1 d至第18 d。經統計學檢驗發現，抗體陽性組的血清學標本采集時間和抗體陰性組的血清學標本采集時間有統計學差異，抗體陰性組的血清學標本采集時間均在病例發病后的7 d以內；而陽性組的血清采集時間都相對較晚，表明病例發病后的抗體產生需要經過一定的時間，過早采集病例的血清標本會降低抗體的檢出率。所以病例發病后的早期采用核酸檢測的方法對于確診新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例來說比較可行，該階段病例可能處于窗口期，血清中抗體還未產生或者產生的量很低，難以檢出。除了采集時間外，血清標本是否滅活對于陽性檢出也存在影響，滅活標本的陽性檢出率略低于未滅活標本[8]。

由于新型冠狀病毒抗體檢測試劑(免疫層析法)的簡便、快捷，盡管其檢測靈敏度沒有達到90%以上，但是在注意其檢測靈敏度的同時，也可以很好的用作臨床診斷的輔助診斷方法，同時可以用于核酸檢測方法的補充。在遇到疑似新型冠狀病毒肺炎暴發疫情時，也可以用該試劑進行篩檢以初步提示疫情性質。