4例新型冠狀病毒感染病例咽拭子與痰標本病毒核酸檢測的比較

陳 煒,張春陽,朱 穎,張炎華,游麗斌,吳冰珊,黃枝妙,鄭奎城,翁育偉

2019年12月在中國湖北省武漢市發生新型冠狀病毒感染的肺炎病例[1]，2020年1月12日，該新型冠狀病毒被命名為“2019-nCoV”[2]，該病毒是一種新型β屬冠狀病毒，屬正冠狀病毒亞科，但形成了另外一簇的進化分枝，成為繼α-冠狀病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63，β-冠狀病毒的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV之后，可以感染人類的冠狀病毒科中的第7個成員。

2020年1月20日我國將新型冠狀病毒感染的肺炎納入法定乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防、控制措施[3]。截至1月31日24時，中國大陸累計報告確診病例11 791例，重癥病例1 795例，死亡病例259例，港澳臺地區通報確診病例30例[4]，泰國、日本、新加坡及美國等二十幾個國家也相繼報告確診病例。2020年1月31日，世界衛生組織宣布新型冠狀病毒感染的肺炎疫情構成“國際關注的突發公共衛生事件”[5]。福建省自2020年1月22日報告首例輸入性新型冠狀病毒感染的肺炎確診病例[6]以來，截至1月31日24時，福建省累計報告新型冠狀病毒感染的肺炎確診病例144例[7]。為比較不同呼吸道標本的病毒核酸檢測效果，我們對收集到的4例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標本開展病毒核酸檢測。

1 材料與方法

1.1標本 收集到2020年1月22日以來福建省各地市上送至省疾控中心的4例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標本。

1.2RNA提取 提取病毒的RNA采用QIAamp viral RNA mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒，從280 μL的標本(咽拭子和痰標本)中獲得50 μL的總RNA溶液，提取的RNA保存在-20 ℃待用。

1.3人體細胞管家基因GAPDH的檢測 應用AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit反應試劑盒(ABI Ambion, Life Technologies, USA)及引物探針(GAPDH-F: 5′-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3′, GAPDH-R: 5′-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3′ GAPDH-Prob: 5′-(FAM)CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG(BHQ1) -3′)，進行人體細胞管家基因GAPDH的檢測。按照試劑盒說明書配制體系，反應程序如下：45 ℃ 10 min, 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40個循環。置ABI 7500儀器上檢測，單點熒光檢測在60 ℃，熒光檢測通道選擇FAM/none，passive reference選擇ROX。判定標準：陽性(Ct值≤37，典型擴增曲線)，灰區(3740或無，無擴增曲線)。

1.4病毒基因ORF 1ab及基因N的檢測 應用AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit反應試劑盒(ABI Ambion, Life Technologies, USA)及實驗室檢測技術指南[8]推薦的引物探針，進行病毒基因ORF 1ab及基因N的檢測。按照試劑盒說明書配制體系，反應程序如下：為45 ℃10 min, 95 ℃10 min; 95 ℃15 s, 55 ℃1 min, 40個循環。置ABI 7500熒光定量PCR儀檢測，單點熒光檢測在55 ℃，熒光檢測通道選擇FAM/none，passive reference選擇ROX。判定標準：陽性(Ct值≤37，典型擴增曲線)，灰區(3740或無，無擴增曲線)。

1.5病毒基因S檢測 應用市場上流通的某商品化試劑進行病毒基因S的檢測，按照試劑說明書配制體系和設置反應條件，放置Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀檢測。按照試劑說明書判定結果。

2 結 果

2.1人體細胞管家基因GAPDH的檢測 4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標本中，人體細胞管家基因GAPDH均呈現明顯典型的擴增信號曲線(圖1)。但痰標本中人細胞管家基因GAPDH擴增曲線信號強于咽拭子，CT值均低于咽拭子(表1)。

圖1 4例2019-nCoV確診病例咽拭子(TS)和痰(S)標本的人細胞管家基因GAPDH的擴增曲線Fig.1 Amplification curves of human cell housekeeping gene GAPDH in throat swab (TS) and sputum (S) specimens from 4 2019-nCoV confirmed

表1 4例2019-nCoV確診病例咽拭子和痰標本相關基因核酸檢測CT值
Tab.1 CT value of gene nucleic acid detection in throat swab and sputum samples of 4 2019-nCoV confirmed cases

CaseSpecimensCTGAPDHORF 1abNS1Throat swabs28.3236.635.4431.65sputum22.7730.2432.1424.382Throat swabs26.7124.2324.9720.02sputum23.0320.6221.315.783Throat swabs26.7625.2625.6620.74sputum24.3923.2022.4918.064Throat swabs25.5436.5136.30-sputum22.1723.4021.8018.57

2.2病毒ORF 1ab基因及N基因的檢測 采用實驗室檢測技術指南發布的2019-nCoV熒光PCR檢測引物和探針對4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標本分別進行病毒基因ORF 1ab(圖2)及基因N(圖3)核酸檢測。結果顯示，4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標本，無論是病毒基因ORF 1ab還是基因N的熒光信號擴增曲線中，痰標本的擴增曲線信號均比咽拭子強。其中，在病例1和病例4，咽拭子的病毒基因ORF 1ab及基因N的熒光信號均很微弱，而痰標本的信號則較明顯。同樣，痰標本中病毒基因ORF 1ab及基因N擴增曲線的CT值均低于咽拭子(表1)。

2.3病毒S基因檢測 應用商品化試劑對4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標本進行病毒基因S(圖4)核酸檢測。結果顯示，痰標本中病毒基因S的擴增曲線信號強于咽拭子，CT值均低于咽拭子(表1)。而在病例4的病毒基因S核酸檢測中，咽拭子呈現陰性結果。

3 討 論

本研究對4例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標本分別進行人體細胞GAPDH管家基因、病毒ORF 1ab基因、N基因及S基因核酸檢測與比較。GAPDH管家基因幾乎在所有組織中都高水平表達，在同種細胞或者組織中的表達量一般是恒定的。本研究通過檢測咽拭子和痰標本的GAPDH管家基因來評估標本的采集質量及核酸提取質量，結果表明這4例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標本的標本質量及核酸提取效果均符合要求。

對于新型冠狀病毒的實驗室檢測，我們采用實驗室檢測技術指南發布的2019-nCoV熒光PCR檢測引物和探針對4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標本分別進行病毒ORF 1ab基因及N基因核酸檢測，用市場流通的某商品化試劑對病毒S基因進行核酸檢測。結果均表明，痰標本的病毒含量均高于咽拭子標本，痰標本的檢測效果優于咽拭子，其中，在病例1和4表現更加明顯，特別在病例4的咽拭子標本檢測中，商品化試劑呈現陰性結果，而痰標本則呈現非常明顯的陽性結果。且在病毒核酸提取過程，我們采取雙倍標本(280 μL)提取核酸，如果采取常規的140 μL標本提取，病例1和4的核酸檢測，可能都會出現陰性結果導致漏檢。在痰標本的液化過程中，我們采用等體積的1%胰酶(AMRESCO, Solon, Ohio, USA)與痰液混合37 ℃孵育震蕩液化15 min，但是痰標本的液化效果依舊不是很理想，如果能找到更佳的液化痰標本的方法，那么從痰標本中獲取的病毒含量可能更高，更有利于實驗室檢測。

圖2 4例2019-nCoV確診病例咽拭子(TS)和痰(S)標本的病毒ORF 1ab基因的擴增曲線Fig.2 Amplification curves of viral gene ORF 1ab in throat swab (TS) and sputum (S) specimens from 4 2019-nCoV confirmed cases

圖3 4例2019-nCoV確診病例咽拭子(TS)和痰(S)標本的病毒N基因的擴增曲線Fig.3 Amplification curves of viral gene N in throat swab (TS) and sputum (S) specimens from 4 2019-nCoV confirmed cases

圖4 4例2019-nCoV確診病例咽拭子(TS)和痰(S)標本的病毒基因S的擴增曲線Fig.4 Amplification curves of viral gene S in throat swab (TS) and sputum (S) specimens from 4 2019-nCoV confirmed cases

痰標本的病毒含量高于咽拭子標本，可能與新型冠狀病毒主要侵襲感染下呼吸道細胞有關，進而產生咳嗽、肺炎等臨床表現。同時，本研究結果也提示，在新型冠狀病毒感染肺炎病例實驗室確診及出院實驗室診斷時，以咽拭子病毒核酸檢測陰性作為排除感染及治愈標準在實施過程中需謹慎，必要時應當采集痰等其他標本進行檢測。此外，本結果也提示，當前疫情防控措施需要增加宣傳公眾特別是肺炎患者不隨地吐痰，加強痰液管理及公共場所地面環境的衛生消毒工作。

了解新型冠狀病毒在咽拭子、痰液、血液及糞便不同標本中的病毒含量及存在時間，是實驗室診斷新型冠狀病毒感染肺炎病例及判斷病例治愈的重要環節。本研究結果為新型冠狀病毒實驗室檢測中標本的選擇及防控措施等提供了一些建議。由于標本數量較少，在此后工作中，將進一步收集更多的數據進行比較分析。