液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)聯(lián)合細(xì)胞DNA定量分析對(duì)良惡性胸腹水患者的診斷價(jià)值*

李楣， 張麗麗， 姚蓓， 夏靜， 余文靜， 肖娟， 候秋萍

(重慶市第十三人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 重慶 400053)

腫瘤包含惡性腫瘤與良性腫瘤，胸腹水是腫瘤患者主要的臨床癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)及時(shí)就醫(yī)，以免延誤最佳治療時(shí)間[1-3]。臨床上胸腹水可分為良性胸腹水和惡性胸腹水，不同原因?qū)е碌男馗顾男再|(zhì)、治療和預(yù)后截然不同，因此快速而準(zhǔn)確地診斷其良惡性對(duì)原發(fā)病的治療和預(yù)后均有重要意義[4-5]。液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)的制片流程簡(jiǎn)便、特異性高，但敏感性低、需要經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生參與閱片診斷，難以用于腫瘤的早期篩查[6-7]?，F(xiàn)代研究表明，細(xì)胞脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)定量分析是建立在基因水平的、對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行快速測(cè)量并自動(dòng)分析的新技術(shù)，可用于胸腹水中細(xì)胞DNA的定量分析，但該方法容易受致病菌感染等因素的影響，出現(xiàn)DNA異倍體現(xiàn)象，特異性不高[8]。目前關(guān)于將液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)聯(lián)合細(xì)胞DNA定量分析進(jìn)行胸腹水良惡性診斷的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且未有定論，因此本研究旨在探討液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)聯(lián)合細(xì)胞DNA定量分析對(duì)良惡性胸腹水的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料、主要試劑與儀器

1.1.1資料 收集2018年11月-2019年8月收治的疑似腫瘤患者的臨床資料，且所有患者以組織病理學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)鑒別良惡性胸腹水，要求有腫瘤的組織病理學(xué)診斷依據(jù)(包括肺癌、乳腺癌和淋巴瘤等疾病)、首次接受液基薄層細(xì)胞制片及細(xì)胞DNA定量分析者、未接受腫瘤治療者、年齡≥50歲，排除肝腎等重要臟器功能不全者、有血液系統(tǒng)疾病者、意識(shí)障礙者及臨床資料不全者等。最終納入疑似腫瘤患者97例，男性56例、女性41例，年齡50～71歲、平均(54.12±2.34)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)為(16.78±1.23)kg/m2，胸水55例、腹水42例，組織病理學(xué)診斷惡性腫瘤58例、良性腫瘤39例。

1.1.2主要試劑與儀器 巴氏染液試劑(湖北孝感德立森)，硫堇染色液(武漢蘭丁醫(yī)學(xué))；DCT-06液基超薄細(xì)胞制片儀(湖北孝感德立森)，LD DNA-ICMIl細(xì)胞DNA定量檢測(cè)分析儀(武漢蘭丁醫(yī)學(xué))。

1.2 方法

1.2.1液基薄層細(xì)胞制片 收集患者胸腹水標(biāo)本100 mL，3 000 r/min離心15 min，棄上清液，留取沉淀物檢查；吸取沉淀加入到保存液中，上機(jī)制作液基薄層細(xì)胞涂片，固定、巴氏染色，400倍顯微鏡下閱片見(jiàn)可疑癌細(xì)胞或癌細(xì)胞為陽(yáng)性[8]。

1.2.2細(xì)胞DNA定量檢測(cè)與判斷 收集患者100 mL胸腹水標(biāo)本，方法同1.2.1，制作涂片，采用福爾根染色法對(duì)細(xì)胞核染色測(cè)量DNA含量(福爾根染色中的細(xì)胞核著色深淺度與DNA含量成正比)；通過(guò)光學(xué)自動(dòng)三維移動(dòng)平臺(tái)對(duì)福爾根染色的細(xì)胞核進(jìn)行自動(dòng)掃描，測(cè)定細(xì)胞核的積分光密度值(integrated optical density,IOD)及核面積等99個(gè)參數(shù)，計(jì)算DNA指數(shù)(DNA index，DI)或DNA含量(c)大小判斷細(xì)胞的異常情況，規(guī)定DI=1～2或DNA含量=2～4 c為正常細(xì)胞，DI=2～2.5或DNA含量=4～5 c為細(xì)胞增殖期，DI>2.5或DNA含量>5 c為異常細(xì)胞，判定為陽(yáng)性[9]。

1.2.3聯(lián)合檢測(cè) 液基薄層細(xì)胞制片見(jiàn)可疑癌細(xì)胞或癌細(xì)胞，且DI>2.5或細(xì)胞DNA含量>5 c為異常細(xì)胞，判定為陽(yáng)性[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以n(%)表示計(jì)數(shù)資料，與組織病理學(xué)診斷結(jié)果的一致率比較使用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，計(jì)算各檢測(cè)方法對(duì)良惡性胸腹水鑒別診斷中的準(zhǔn)確率、靈敏度、特異性、陰性及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，其中診斷的準(zhǔn)確率與靈敏度比較使用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢查方法與組織病理學(xué)診斷結(jié)果的比較

液基薄層細(xì)胞制片檢測(cè)可見(jiàn)典型的腫瘤細(xì)胞團(tuán)，乳頭樣或腺樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核增大，核仁明顯，染色質(zhì)粗，核膜不規(guī)則，診斷為可見(jiàn)癌細(xì)胞(圖1)；細(xì)胞DNA定量分析可見(jiàn)大量異倍體細(xì)胞及異倍體細(xì)胞峰出現(xiàn)(圖2)；不同檢查方法與組織病理學(xué)診斷結(jié)果比較顯示，液基薄層細(xì)胞制片、細(xì)胞DNA定量分析分別與組織病理學(xué)診斷陽(yáng)性率相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但聯(lián)合檢測(cè)與組織病理學(xué)診斷陽(yáng)性率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 不同檢查方法的符合率

聯(lián)合檢測(cè)診斷符合率分別高于液基薄層細(xì)胞制片和細(xì)胞DNA定量分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但液基薄層細(xì)胞制片與細(xì)胞DNA定量分析診斷符合率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 典型病例右側(cè)胸腔積液標(biāo)本液基薄層細(xì)胞制片(400×)Fig.1 A thin layer cell section of the right pleural effusion specimen of a typical case (400×)

注：A為細(xì)胞數(shù)量，儀器掃描可見(jiàn)大量異倍體細(xì)胞及異倍體細(xì)胞峰(標(biāo)本號(hào):D191360；被測(cè)細(xì)胞：4 855；參考細(xì)胞：0；>5 c細(xì)胞：551；細(xì)胞總數(shù)：4 855；二倍體細(xì)胞：984；被測(cè)細(xì)胞比例：100%；均值：1；標(biāo)準(zhǔn)差：0.029；變異系數(shù)；1.444)；B為細(xì)胞核面積，儀器掃描可見(jiàn)細(xì)胞核面積增大；DNA含量<5 c為正常。

圖2 典型病例右側(cè)胸腔積液標(biāo)本的細(xì)胞DNA定量分析
Fig.2 DNA quantitative analysis of right pleural effusion specimen in a typical case

表1 不同檢查方法良惡性腫瘤檢出結(jié)果與組織病理學(xué)診斷結(jié)果比較[n(%)]Tab.1 Comparison of benign and malignant tumor detection results and histopathological diagnosis results by different examination methods[n(%)]

表2 不同檢查方法良惡性腫瘤診斷符合率的比較[n(%)]Tab.2 Comparison of diagnostic accuracy of different examination methods for benign and malignant tumors[n(%)]

注：(1)與液基薄層細(xì)胞制片比較，P<0.05；(2)與細(xì)胞DNA定量分析比較，P<0.05。

2.3 診斷價(jià)值

聯(lián)合檢測(cè)診斷良惡性積液的靈敏度分別高于液基薄層細(xì)胞制片和細(xì)胞DNA定量分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；液基薄層細(xì)胞制片、細(xì)胞DNA定量分析及聯(lián)合檢測(cè)間的特異性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合檢測(cè)診斷的陰性預(yù)測(cè)值分別高于液基薄層細(xì)胞制片和細(xì)胞DNA定量分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；液基薄層細(xì)胞制片、細(xì)胞DNA定量分析及聯(lián)合檢測(cè)間的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

注：(1)與液基薄層細(xì)胞制片比較，P<0.05；(2)與細(xì)胞DNA定量分析比較，P<0.05。

3 討論

正常情況下，胸腔內(nèi)存在少量液體起到潤(rùn)滑作用，減少呼吸活動(dòng)過(guò)程中胸膜間摩擦，維持心肺功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，一旦胸腹腔出現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)或炎癥反應(yīng)，便可導(dǎo)致胸腹腔積液，其性質(zhì)也隨之變化[10-12]。大部分腫瘤轉(zhuǎn)移患者存在不同程度胸腹水，因此更早地發(fā)現(xiàn)癌前病變細(xì)胞，進(jìn)行預(yù)防和相關(guān)臨床處理，快速鑒別胸腹水的良惡性在臨床中有重要意義[13]。

近年來(lái)，液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)逐步用于胸腹水、尿液及痰液標(biāo)本等非婦科領(lǐng)域脫落細(xì)胞學(xué)檢查[14]。本研究結(jié)果表明，以組織病理學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)特異性較高，其與組織病理學(xué)診斷結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其診斷良惡性腫瘤的靈敏度不高，這可能是由于液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)通過(guò)對(duì)制片方式和流程的改善，優(yōu)化了制片效果，提高了陽(yáng)性檢測(cè)率，一定程度上對(duì)傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)中的部分缺點(diǎn)進(jìn)行了彌補(bǔ)[15-16]。但該法主要是形態(tài)學(xué)定性診斷，采集的胸腹水中細(xì)胞數(shù)量水平較低，部分細(xì)胞形態(tài)較為相似，這些原因?qū)膊〉蔫b別判斷帶來(lái)了一定的影響，難以獨(dú)立實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥早期階段的有效篩查[17]。因此液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)仍然存在爭(zhēng)議，本研究結(jié)果也和Inage等[18]研究結(jié)果類似。

細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)具有對(duì)流動(dòng)狀態(tài)下的細(xì)胞進(jìn)行快速、大量及多參數(shù)分析的特點(diǎn)，臨床價(jià)值及準(zhǔn)確度較高[19]。正常人體細(xì)胞的DNA含量較為恒定，為2倍體細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂期時(shí)，細(xì)胞DNA含量增加甚至倍增，形成4倍體細(xì)胞[20]。在細(xì)胞癌變時(shí)，染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目均會(huì)發(fā)生異常，出現(xiàn)DNA異倍體，DNA異倍體細(xì)胞的出現(xiàn)是判斷惡性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一[21-23]。本研究通過(guò)對(duì)樣本細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量或染色體倍體的測(cè)定來(lái)判斷細(xì)胞的生理狀態(tài)和病理改變，結(jié)果顯示，以組織病理學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞DNA定量分析與組織病理學(xué)診斷結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其診斷符合率及靈敏度處于居中位置，均高于液基薄層細(xì)胞制片，但低于聯(lián)合檢測(cè)方法，這可能是由于患者的胸腹水中存在分裂時(shí)期的病變細(xì)胞，即異倍體，且在細(xì)胞惡變過(guò)程中細(xì)胞DNA含量早于細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，但細(xì)胞DNA定量分析系統(tǒng)僅能判斷DNA倍體已經(jīng)發(fā)生變化的腫瘤細(xì)胞，對(duì)未發(fā)生改變的腫瘤細(xì)胞不能測(cè)定。這也與Bisht等[24]研究結(jié)果相符。此外，聯(lián)合檢測(cè)診斷的陰性預(yù)測(cè)值分別高于液基薄層細(xì)胞制片和細(xì)胞DNA定量分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但液基薄層細(xì)胞制片與細(xì)胞DNA定量分析診斷符合率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明，液基薄層細(xì)胞制片檢查是醫(yī)師根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變所做的判斷，主觀性較強(qiáng)、易漏診，特異性較高[25-26]；細(xì)胞DNA定量方法靈敏度較液基薄層細(xì)胞制片方法高且更為客觀，但特異性較低[27]。聯(lián)合檢測(cè)可提高惡性胸腹水的診斷陽(yáng)性率，特別是對(duì)液基薄層細(xì)胞診斷不明確，無(wú)法判定良惡性時(shí)，細(xì)胞DNA定量分析輔助判斷細(xì)胞良惡性，提高診斷陽(yáng)性率，降低漏診和誤診發(fā)生率[28-29]。因此，液基薄層細(xì)胞制片和細(xì)胞DNA定量分析具有較好的互補(bǔ)性，聯(lián)合使用較單項(xiàng)檢查靈敏度均有提高，可以克服單項(xiàng)檢查固有的一些缺陷，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，有利于患者疾病的治療，提高治療有效率，在臨床診斷中應(yīng)大力推廣應(yīng)用[30]。

綜上，液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)聯(lián)合細(xì)胞DNA定量分析胸腹水良惡性性質(zhì)具有較高的診斷符合率、靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值，在良惡性胸腹水患者的診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，定性和定量相結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，值得推廣應(yīng)用。