脯氨酰羧基肽酶和血管緊張素轉化酶2在IgA腎病中的表達及其病理意義*

徐晉徉， 何常， 胡斌

(貴州醫科大學附屬醫院 病理科， 貴州 貴陽 550004)

IgA腎病是最常見的原發性腎小球疾病[1]，其病理特征為腎活檢免疫病理顯示IgA或以IgA為主的免疫球蛋白及補體成分在腎小球系膜區呈彌漫性顆粒狀或團塊狀沉積，有時可伴有毛細血管袢沉積，可引起一系列的臨床及病理改變[2]， 20%～40%的IgA腎病患者在20年內發展為終末期腎病(end-stage renal disease，ERSD)[3-4]。腎臟組織中除經典的腎素-血管緊張素系統(RAS)，即循環RAS外，還有著獨立的RAS系統。有研究顯示，獨立的RAS系統可能與腎臟的炎癥疾病存在一定關系[5-6]。本研究以RAS系統為中心，選擇RAS系統的2個相關蛋白脯氨酰羧基肽酶(prolylcarboxypeptidase，PRCP)、血管緊張素轉化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)為研究對象，觀察其在IgA腎病患者的腎穿刺組織中的表達，分析PRCP、ACE2表達與各類型IgA腎病病變程度的關系，探討RAS系統在IgA腎病的發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 收集54例醫院病理科經腎穿刺活檢明確診斷為IgA腎病患者的腎活檢組織標本作為IgA腎病組。納入標準：所有標本由一位高級職稱病理醫師獨立閱片，所有標本均經蘇木素-伊紅(HE)染色、六胺銀(PASM)染色、馬松三色(Masson)染色、過碘酸雪夫(PAS)染色、結合IgG、IgA、IgM、C3、C1q、Fib、HbsAg、HbcAg、HP等免疫熒光染色以及電鏡確診為IgA腎病。排除由糖尿病、過敏性紫癜、乙型肝炎感染、肝硬化、系統性紅斑狼瘡、惡性腫瘤等系統性疾病引起的繼發性腎小球疾病，排除先天性遺傳性腎臟疾病，排除在本次腎臟穿刺明確診斷前有血管緊張素2受體阻滯劑(angiotensin receptor blocker，ARB)或血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)使用史患者，排除缺乏新鮮組織免疫熒光結果而采用石蠟組織免疫熒光輔助診斷者，排除光鏡檢查腎小球數量較少者及臨床病理資料不完整者。54例IgA腎病組患者，男34例、女性20例，年齡12～76歲、中位年齡35歲；按其病變程度分型，局灶增生型20例、IgA腎病合并膜性腎病(membranous nephropathy，MN)20例、新月體型14例。另隨機抽取20例經腎活檢確診為微小病變腎病(minimal change disease，MCD)患者為對照組，排除標準與IgA腎病組相一致，其中男16例、女4例，年齡13～65歲、中位年齡33歲。

1.1.2試劑及方法 一抗：兔抗人多克隆抗體PRCP(工作濃度1 ∶200)，兔抗人多克隆抗體ACE2(工作濃度1 ∶200)購自北京百奧思科生物醫學技術有限公司；二抗：通用二步法試劑盒PV-5000，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1PRCP、ACE2表達 按照試劑盒說明書采用免疫組化法檢測2組的腎穿刺組織的PRCP、ACE2表達，切片染色時使用PBS緩沖液替代一抗進行操作作為陰性對照。

1.2.2結果判定標準 每個標本切片分別選取腎小球區和腎小管區2個部位分別進行評估。(1)腎小管區：在顯微鏡下放大400倍攝取隨機腎小管視野10個/高倍鏡，對所選視野陽性信號用Image-pro Plus圖像分析軟件進行圖像分析；以積分光密度(integral optical density，IOD)該值表示該成分在腎小管間質中的相對表達量[7-8]。(2)腎小球區：以陽性腎小球所占百分比和其染色強度2項評分之積來判斷表達程度[9]，染色強度分為4級評分，不著色(-)計1分，淺黃色(+)計2分，棕黃色(++)計3分，黃褐色(+++)計4分；陽性腎小球所占百分比分為6級評分，無陽性腎小球計0分，陽性率 ≤20%計1分，陽性率 21% ～40%計2分，陽性率 41%～60%計3分，陽性率 61%～80%計4分，陽性率≥81%計5分。每張切片分別由2位有經驗的臨床病理科醫生單獨讀片，當2者之間存在差異時，通過同時使用雙頭顯微鏡以達成共識。(3)新鮮組織免疫熒光示免疫球蛋白及補體成分沉積量評估分為5級進行評分：(-)計0分、(+)計1分、(++)計2分、(+++)計3分、(++++)計4分[10]。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，組間分析采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗(Kruskal-WallisH檢驗)；采用Spearman分析IgA腎病組PRCP、ACE2表達與各類型IgA腎病病變程度的關系；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PRCP、ACE2在腎組織中的分布

IgA腎病的鏡下改變呈多樣性，除系膜細胞及系膜基質增生以外，可以表現為內皮細胞增生、節段性硬化、新月體形成等，亦可見腎小管上皮細胞空泡和顆粒變性、刷狀緣脫落、萎縮及腎間質水腫、纖維化等(見圖1)。在對照組和IgA腎病組的腎組織中PRCP、ACE2均有不同程度的表達，在腎小管及間質區域中主要表達在腎小管上皮細胞，以胞質及胞膜為主，棕黃色呈彌散性分布，在腎間質血管中未見明顯表達；在腎小球區域腎小球壁層、臟層上皮細胞均有表達，以胞膜為主，棕黃色呈線性或顆粒性分布，在新月體中增生的壁層上皮細胞多數呈高表達(見圖2及圖3)。

注：A為細胞性新月體，B為腎小管上皮細胞空泡和顆粒變性。

圖1 IgA腎病的腎小球和腎小管病變
Fig.1 Glomerular and tubular lesions in IgA nephropathy

2.2 PRCP在腎小管區和腎小球區的表達

2.2.1腎小管區 經Kruskal-WallisH檢驗，IgA腎病組PRCP蛋白在腎小管區的表達高于對照組，差異有統計學意義(H=29.455，P<0.05)；進一步比較PRCP蛋白在腎小管區的表達發現，IgA腎病組中局灶增生患者、合并MN患者顯著高于對照組患者(P<0.05)，IgA腎病組中新月體患者與對照組比較、局灶增生患者與合并MN患者比較、局灶增生患者與新月體患者比較，差異無統計學意義(P>0. 05)。提示PRCP在IgA腎病患者腎小管區的表達高于MCD患者，但隨著疾病的進展至新月體型IgA腎病后，PRCP在腎小管區的表達下降至MCD患者水平。見圖2及圖4。

2.2.2腎小球區 經Kruskal-WallisH檢驗，IgA腎病組PRCP蛋白在腎小球區的表達高于對照組，差異有統計學意義(H=52.501，P<0.05)；進一步比較PRCP蛋白在腎小球區的表達發現，IgA腎病組中局灶增生患者、合并MN患者、新月體患者均顯著高于對照組患者(P<0.05)，新月體患者顯著高于局灶增生患者、合并MN患者(P<0.05)。提示PRCP在IgA腎病患者腎小球區的表達高于對照組患者，但隨著疾病的進展，PRCP在腎小球區的表達量逐漸升高。見圖2及圖4。

2.3 ACE2在腎小管區和腎小球區的表達

2.3.1腎小管區 經Kruskal-WallisH檢驗，IgA腎病組ACE2蛋白在腎小球區的表達高于對照組，差異有統計學意義(H=23.669，P<0.05)；進一步比較ACE2蛋白在腎小管區的表達發現，IgA腎病組中局灶增生患者顯著高于合并MN患者和對照組患者(P<0.05)，對照組與合并MN患者比較、局灶增生患者與合并MN患者比較、局灶增生患者與新月體患者比較、合并MN患者與新月體患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)。提示ACE2僅在局灶增生型IgA腎病患者的腎小管區的表達高于對照組患者。見圖3及圖5。

2.3.2腎小球區 經Kruskal-WallisH檢驗，IgA腎病組ACE2蛋白在腎小球區的表達高于對照組，差異有統計學意義(H=56.087，P<0.05)；進一步比較ACE2蛋白在腎小球區的表達發現，IgA腎病組中局灶增生患者、合并MN患者、新月體患者均顯著高于對照組患者(P<0.05)，新月體患者顯著高于局灶增生患者、合并MN患者(P<0.05)。提示ACE2在IgA腎病患者腎小球區的表達高于對照組患者，但隨著疾病的進展，ACE2在腎小球區的表達量逐漸升高。見圖3及圖5。

注：A、a為對照組，B、b為局灶增生，C、c為IgA腎病合并MN，D、d為新月體，其中a～d為腎小管區，A～B為腎小球區。

圖2 IgA腎病組和對照組腎穿刺組織中PRCP蛋白表達(免疫組織化學，×400)
Fig.2 Protein expression in renal puncture tissue of IgA nephropathy group PRCP control group (immunohistochemistry,×400)

注：A、a為對照組，B、b為局灶增生，C、c為IgA腎病合并MN，D、d為新月體，其中a～d為腎小管區，A～B為腎小球區。

圖3 IgA腎病組和對照組腎穿刺組織中ACE2蛋白表達(免疫組織化學，×400)
Fig.3 Expression of ACE2 protein in renal puncture tissue of IgA nephropathy group and control group (immunohistochemistry,×400)

注：(1)與MCD組比較，P<0.05；(2)與局灶增生組比較，P<0.05。

圖4 對照組和各IgA腎病組患者腎穿刺組織中PRCP蛋白表達IOD值及腎小球評分比較
Fig.4 Comparison ofIODvalues glomerular score of PRCP protein expression in renal puncture tissues of control group and nephrotic group

注：(1)與MCD組比較，P<0.05；(2)與局灶增生組比較，P<0.05。

圖5 對照組和各IgA腎病組患者腎穿刺組織中ACE2蛋白表達IOD值及腎小球評分比較
Fig.5 Comparison ofIODvalues glomerular score of ACE2 protein expression in renal puncture tissues of control group and nephrotic group

2.4 IgA腎病患者組織中PRCP、ACE2的表達與IgA在腎小球中沉積的相關性

Superman相關分析結果顯示，PRCP在腎小球區的表達與IgA在腎小球中的沉積呈負相關(r=-0.301，P=0.0027)，ACE2在腎小球區的表達與IgA在腎小球中的沉積呈正相關(r=0.306，P=0.024)。

3 討論

IgA腎病是世界范圍內最普遍的原發性腎小球疾病，尤其以亞洲地區人群發病率最高[11]，任何年齡均可發病，以兒童和青少年最為常見[12]。目前對于IgA N的發病機制的認識還不明確，主要認為與異常糖基化的IgA的產生有關[13]，腎穿刺活檢免疫熒光檢測可見IgA為主的免疫球蛋白及補體成分在腎小球系膜區沉積。明確其發病機制對指導疾病臨床治療、改善預后是至關重要的。

RAS系統是人類調節血壓和液體平衡最重要的激素系統之一，臨床上通過各類藥物中斷或影響這個系統中的不同反應階段從而達到控制血壓，改善心力衰竭，改善腎功能衰竭等目的[14]。目前研究認為在腎臟組織中存在與循環RAS系統互相關聯并相對獨立的局部RAS系統[15]。有研究報道，可能與IgA腎病和/或腎臟疾病高度相關的蛋白有PRCP[16]。PRCP作為RAS系統與激肽釋放酶-激肽系統(KKS)重要的連接點，在一些報道中發現在炎癥相關的腎臟疾病的發展的各個連續階段有血漿PRCP水平的升高[17]。另外在大量糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的研究中發現ACE2可通過影響組織微循環進而對糖代謝以及腎組織病變產生作用，也可通過改變機體氧化應激水平、影響腎小管上皮間充質轉分化等參與DN的病變過程[18]，并逐漸開始作為DN診斷和治療的新靶點[19]，但在IgA腎病的領域研究較少[20]。

本研究采用免疫組化的方法針對PRCP、ACE2的研究顯示，PRCP、ACE2在IgA腎病患者的腎組織中高表達，在對照組的MCD患者腎臟組織中少量表達，兩者之間的差異有統計學意義(P<0.05)，主要定位在腎小管上皮細胞上，以胞質和胞膜為主，棕黃色呈彌散性分布，另外在腎小球系膜系膜、壁層上皮細胞、臟層上皮細胞也有表達，以胞膜為主，棕黃色呈線性或顆粒性分布，但在腎間質血管及各類炎癥細胞中未見明顯表達。通過對IgA腎病不同病理表現分組的組間統計分析可見，隨著疾病的進展，PRCP與ACE2在腎小球區域和腎小管區域的表達呈現出不同的發展趨勢，PRCP及ACE2在腎小球區的表達量隨疾病發展逐漸升高，尤其在形成新月體的腎小球中增生的壁層上皮細胞高表達，而在腎小管區的表達量隨疾病發展逐漸下降，推測腎間質纖維化，腎小管上皮萎縮，其分泌的蛋白量減少。Superman相關分析結果顯示，PRCP在腎小球區的表達與IgA在腎小球中的沉積呈負相關(r=-0.301，P=0.0027)，ACE2在腎小球區的表達與IgA在腎小球中的沉積呈正相關(r=0.306，P=0.024)。異常糖基化的IgA現階段被認為是IgA腎病的主要發病機制[21]，ACE2的表達與其沉積量相關，ACE2也很可能在IgA腎病的發生發展過程中起著重要作用。

綜上所述，在IgA腎病的進展過程中，伴隨著PRCP、ACE2分泌量的變化，RAS系統可能在IgA腎病的發生發展過程中起到一定作用，但其具體作用機制還不十分清楚，還需進一步研究。對于PRCP、ACE2等RAS系統相關蛋白的檢測，對于判斷腎病的預后有一定幫助。