Flavaglines類化合物對人白血病HEL細胞的作用及機制*

龍群， 肖瀟， 宋晶睿， 饒青， 苑春茂， 何志旭， 李艷梅**

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 免疫教研室 & 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550014； 3.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室， 貴州 貴陽 550014)

白血病是由于基因突變導致造血干細胞或造血祖細胞惡性克隆增生的一種血液腫瘤，全世界每年至少有54 000人被診斷為白血病，5年存活率低于60%；據2018年全球數據表明，960萬癌癥相關死亡病例中白血病死亡病例占比3.2%[1-2]。白血病對人類健康的威脅主要是因為惡性增殖、凋亡受阻和分化障礙等因素可形成白血病細胞，而后在骨髓和肝脾等組織器官中大量增殖、廣泛浸潤，最終導致白血病患者出現貧血、出血、發熱、易感染、肝脾淋巴結腫大及疼痛等臨床表現[3]。目前白血病主要有化學治療、放射治療、靶向治療、免疫治療及干細胞移植等治療方法[4-5]，部分白血病患者的預后可以得到極大的改善，相當多的患者可獲得治愈或者長期穩定緩解；但也有部分病人在臨床治療過程中會復發、藥物抗性和發生其它副作用[6]，因此白血病的治療仍然是大家關注的重點之一。科學家正不斷探索新的針對白血病的化療藥物，其中靶向貓肉瘤病毒麥克唐納株[Feline sarcoma virus (strain McDonough)，FMS]樣的酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，Flt3)的米哚妥林(protein kinase C 412，PKC412)已于2017年獲得批準上市[7]，另外靶向絲裂原活化蛋白激酶(MAPK/Erk kinase , MEK)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)基因、腫瘤蛋白53(tumour protein 53, TP53)、信號轉導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)等抑制劑藥物也正在研究中[8-9]。Flavaglines是一類具有環戊烷苯并呋喃骨架的復雜天然產物[10]，在腫瘤細胞中具有良好活性，但是對非腫瘤細胞卻幾乎沒有毒性或是毒性很小[11-12]，因此受到了化學家和生物學家的廣泛關注。雖然Flavaglines在腫瘤細胞中的活性報道已經很多，但其對白血病中的作用機制研究并不多，尤其是在人白血病細胞系(human erythroleukemia，HEL)細胞中的研究更少，因此本研究主要對Flavaglines類化合物(M8、M9)在白血病HEL細胞中抑制增殖的作用及機制進行初步研究，以擴大抗白血病藥物研究的藥庫。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1化合物及細胞株 Flavaglines(M8和M9)由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室苑春茂老師課題組合成，阿霉素(10 mg/支)購于中國碧云天公司；HEL細胞由加拿大多倫多大學惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 胎牛血清購于美國VACCA公司，RPMI1640培養基購于美國Giboc公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于上海Sangon公司，四唑鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)試劑、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液(immunol precipitation, IP)及蛋白酶抑制劑(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)購于北京索萊寶公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司，Bcl-2及c-Myc抗體購于美國Abcam公司，Caspase 3和磷酸化信號傳導與活化轉錄因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-Stat3)購于美國CST公司，GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)購于中國正能；3111細胞培養箱和1384型A2型超凈工作臺購于美國Thermo公司，Axio Vert A1倒置顯微鏡購于美國ZEISS公司，Synergy 2Multi-ModeReader多功能酶標儀購于美國BioTek公司，NovoCyte 2040R流式細胞儀購于美國ACEA公司。

1.2 方法

1.2.1HEL細胞培養 HEL細胞使用含5%血清的培養基于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.2.2MTT法檢測化合物活性 取處于對數生長期的HEL細胞計數均勻鋪板于96孔板中，細胞濃度為6 000個/孔；陽性對照藥阿霉素(0.100、0.050、0.030、0.010及0.006 μmol/L)、化合物M8(0.20、0.10、0.05、0.03及0.01 μmol/L)和M9(2.50、1.25、0.63、0.30及0.16 μmol/L)，分別對HEL細胞作用72 h后，加入MTT試劑10 μL，培養箱中反應4 h，3 000 r/min離心30 min，吸盡多余液體后再加入二甲基亞砜溶解結晶160 μL；用多功能酶標儀在490 nm吸收光處讀取吸光度值(optical delnsity，OD)，計算各濃度藥物對HEL細胞的抑制率[抑制率(%)=(對照組OD-治療組OD)/對照組OD×100%]，運用Forecast通過抑制率計算半抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 取處于對數生長期的HEL細胞計數鋪板于6孔板中，細胞濃度為20×107個/L；根據1.2.2項下IC50分別設置化合物M8為0.20、0.05及0.02 μmol/L，化合物M9為1.00、0.50及0.25 μmol/L，均以DMSO組為對照，分別培養24、48及72 h；收集細胞，預冷PBS洗2次，采用Annexin V-FITC/PI 雙染法在流式細胞儀上檢測HEL細胞的凋亡率。

1.2.4Western blot檢測HEL細胞相關蛋白的表達 在HEL細胞生長到對數生長期時，收集細胞計數鋪板于60 mm×60 mm的小皿中，細胞濃度為50×107個/L。藥物組設置M8(0.20 μmol/L)和M9(1.00 μmol/L)，以DMSO為對照組，處理HEL細胞24 h后收集細胞，預冷PBS充分洗掉培養基；加蛋白酶抑制劑的IP裂解液(IP ∶PMSF=100 ∶1)冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，去除絮狀沉淀；BCA蛋白定量試劑盒測定提取的蛋白濃度，確定上樣量；用5×SDS buffer，95 ℃變性5 min；按蛋白質分子量進行100 V SDS-PAGE電泳120 min，膠上的蛋白質用220 mA的恒流，120 min 轉到PVDF 膜，3%BSA室溫封閉1 h，孵育一抗Bcl-2、Caspase3、p-Stat3、c-Myc及GAPDH(4℃過夜)；孵育一抗完成后用1×TBS洗3次，室溫敷二抗2 h(慢搖)，用1×TBS洗3次后用Odyssey 紅外成像儀上掃膜分析蛋白表達情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 化合物M8和M9的活性

化合物M8、M9的結構如圖1所示，以環戊烷苯啶呋喃為基本骨架，R1=OH為化合物M8，R1=CL為化合物M9；MTT法檢測結果顯示，化合物M8(0.20、0.10、0.05、0.03及0.01 μmol/L)、M9(2.50、1.25、0.63、0.30及0.16 μmol/L)及阿霉素(0.100、0.050、0.030、0.010及0.006 μmol/L)對HEL細胞作用72 h后，對HEL細胞的抑制率均隨濃度的增加而增高(P<0.05或P<0.01)；通過計算，化合物M8、M9及阿霉素的IC50值分別為(0.02±0.010)μmol/L、(0.21±0.060)μmol/L及(0.06±0.001)μmol/L，與阿霉素和化合物M9比較，化合物M8在HEL細胞中的IC50值較小(P<0.01)。見圖2。

注：R1=OH，為M8；R1=Cl，為M9。

圖1 化合物M8和M9的結構
Fig.1 Structure of compounds M8 and M9

注：與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖2 阿霉素、化合物M8、M9對HEL細胞作用72 h后的抑制率
Fig.2 Cell growth inhibition rates of doxorubicin, compounds M8 and M9 on HEL cells after 72 h of treatment

2.2 化合物M8和M9對HEL細胞凋亡的影響

流式細胞檢測結果顯示，與各時間點DMSO組比較，化合物M8和M9組HEL細胞的凋亡率均隨濃度的增加而增高(P<0.05或P<0.01)。見圖3和圖4。

注：A為M8，B為M9。

圖3 化合物M8和M9對HEL細胞作用24、48及72 h時的流式細胞儀凋亡檢測結果
Fig.3 Apoptosis rates of compounds M8 and M9 on HEL cells after 24,48 and 72 h of treatment

注：A為M8，B為M9；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖4 化合物M8和M9對HEL細胞作用24、48及72 h的細胞凋亡
Fig.4 Apoptosis rates of compounds M8 and M9 on HEL cells after 24,48 and 72 h of treatment

2.3 化合物M8和M9對HEL細胞相關蛋白的影響

Western blot結果顯示，與DMSO組比較，化合物M8(0.20 μmol/L)和M9(1.00 μmol/L)組HEL細胞中Bcl-2、Caspase3、p-Stat3及c-Myc蛋白的表達減少(P<0.05或P<0.01)，Cleave-Caspase3蛋白明顯增加(P<0.01)。見圖5。

注：A為Western blot檢測結果；B為蛋白相對表達量直條圖；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖5 化合物M8和M9作用24 h后HEL細胞相關蛋白的表達
Fig.5 Expression levels of related proteins of compounds M8 and M9 on the on HEL cells after 24 h of treatment

3 討論

本研究結果顯示，化合物M8、M9及陽性對照藥阿霉素對HEL細胞作用72 h后，抑制HEL細胞增殖的抑制率均隨濃度的增加而增高，與DMSO組比較，差異有統計學意義(P<0.05 或P<0.01)，72 h的IC50值分別為(0.02±0.010)μmol/L、(0.21±0.060)μmol/L及(0.06±0.001)μmol/L，與阿霉素和M9比較，化合物M8在HEL細胞中的IC50值較小(P<0.01)，提示化合物M8在HEL細胞中的活性優于陽性對照藥阿霉素及化合物M9；流式細胞儀結果顯示，化合物M8、M9對HEL細胞分別作用24、48及72 h后均能促進HEL細胞發生凋亡，凋亡率也隨濃度的增加而增高，與各時間點DMSO組比較，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，提示化合物M8、M9可以通過促進HEL細胞凋亡發揮抗白血病作用。在蛋白水平上，化合物M8、M9能夠抑制Bcl-2、Caspase3、p-Stat3及c-Myc蛋白的表達(P<0.05或P<0.01)，并使Cleave-Caspase3明顯增多(P<0.01)，說明化合物M8、M9可通過調控Stat3/c-Myc信號通路來促進白血病HEL細胞凋亡。

已知，Bcl-2蛋白是細胞內源性凋亡的主要調節因子，與線粒體損傷的細胞凋亡密切相關[13]。事實上，Bcl-2已經成為刺激各種癌細胞凋亡的最有價值的靶點之一[14-15]。如靶向Bcl-2的ABT-737、Navitoclax和Venetoclax等小分子抑制劑在體內和體外都顯示了良好的療效[16-17]。而Caspase3的激活則是啟動凋亡程序的必經之路[18]。由此可見，Flavaglines(M8和M9)可通過下調抗凋亡蛋白Bcl-2來激活Caspase3蛋白，從而促進白血病HEL細胞凋亡，而不是細胞壞死。凋亡是細胞的一種程序性死亡，與細胞壞死不同，凋亡細胞發生形態學變化，如細胞皺縮、核凝結、DNA斷裂及膜泡形成等，但不破壞細胞膜的完整性，對細胞周圍產生的炎癥反應很輕[19]，這在腫瘤的治療上具有重要意義，因此目前很多抗腫瘤藥物的研究都是從誘導腫瘤細胞凋亡的機制入手[20-22]。

在前期的研究中，Flavaglines主要是通過抑制翻譯起始因子eIF4A調控MAPK信號通路，從而誘導腫瘤細胞凋亡[23-24]，但本研究結果顯示化合物M8和M9可以使p-Stat3明顯減少(P<0.01)。已知，Stat3是一種信號傳導活化轉錄因子，在細胞中起到傳遞信號和啟動基因轉錄的雙重作用[25]，Stat3信號異常可通過抑制細胞凋亡，誘導細胞增殖、血管生成、侵襲和轉移，誘發炎癥等促進腫瘤的發生和進展，更關鍵的是在腫瘤耐藥方面中扮演了重要角色[26]。許多研究已證明Stat3在白血病、乳腺癌、胃癌及肺癌等多種人類腫瘤中過度激活，并與預后相關[25-28]。因此，鑒定和開發靶向抑制Stat3激活的新型藥物已經成為一個腫瘤治療的方向[29]。本研究結果還顯示，M8和M9可以明顯抑制c-Myc蛋白的表達(P<0.01)。c-Myc蛋白是一種經典的原癌蛋白，在造血干細胞的自我更新、增殖、分化中起重要調控作用，但在大多數腫瘤中過度表達[30]；同時c-Myc蛋白又是由Stat3下游靶點基因c-myc編碼表達的蛋白質，因此抑制p-Stat3/c-Myc的表達，對腫瘤的治療尤其是白血病的治療具有重要意義[31]。

綜上所述，Flavaglines化合物M8、M9對白血病HEL細胞均具有良好的活性，且M8活性優于陽性藥阿霉素和M9；初步探討了Flavaglines化合物M8、M9作用于Stat3/c-Myc信號通路促進白血病HEL細胞凋亡的機制，提示化合物M8、M9在抗白血病治療中具有潛在的應用價值，其具體的抗白血病分子機制值得進一步研究。