vvi-miR160s介導(dǎo)VvARF18應(yīng)答赤霉素調(diào)控葡萄種子的發(fā)育

白云赫，王文然，董天宇，管樂，宿子文，賈海鋒，房經(jīng)貴，王晨

vvi-miR160s介導(dǎo)應(yīng)答赤霉素調(diào)控葡萄種子的發(fā)育

白云赫，王文然，董天宇，管樂，宿子文，賈海鋒，房經(jīng)貴，王晨

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095）

【】研究vvi-miR160家族（vvi-miR160s）及其靶基因在‘魏可’葡萄種子發(fā)育過程中的作用，探究其應(yīng)答赤霉素（GA）調(diào)控葡萄果實(shí)無核的潛在機(jī)理。采用miR-RACE、生物信息學(xué)分析、RT-qPCR、RLM-RACE等方法，鑒定vvi-miR160家族成員及其靶基因，分析vvi-miR160s及其靶基因應(yīng)答GA的時(shí)空表達(dá)模式及其潛在功能。花前GA處理強(qiáng)烈抑制‘魏可’葡萄胚珠及種子發(fā)育，高效誘導(dǎo)其無核，且無核率達(dá)99.8%。克隆鑒定了前體基因序列（501 bp）及成熟體序列，且它們?cè)诓煌锓N間具有較高的保守性；基于vvi-miR160s序列，預(yù)測(cè)到靶基因，利用RLM-RACE技術(shù)檢測(cè)到vvi-miR160s對(duì)的裂解位點(diǎn)在第10和第11位之間，裂解頻度9/17，證明是vvi-miR160s的真實(shí)靶基因。該靶基因編碼683個(gè)氨基酸，在398—411位存在核定位信號(hào)，且該蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核上。VvARF18與其他物種間序列的同源保守性較高，基因結(jié)構(gòu)相似，其中VvARF18蛋白與茶、煙草、梅花等物種親緣關(guān)系較近。啟動(dòng)子中包含4種作用元件，且含有較多激素相關(guān)元件。RT-qPCR結(jié)果顯示，隨著葡萄果實(shí)的發(fā)育，vvi-miR160c/d/e呈現(xiàn)‘V’形表達(dá)趨勢(shì)，在硬核種子發(fā)育期表達(dá)較低，而表現(xiàn)出與前者相反的表達(dá)趨勢(shì)，在硬核種子發(fā)育期呈現(xiàn)高表達(dá)，表明vvi-miR160c/d/e對(duì)負(fù)調(diào)控，但vvi-miR160a/b與表達(dá)水平卻不存在明顯負(fù)相關(guān)。GA處理極顯著地上調(diào)了vvi-miR160a/b在葡萄硬核種子發(fā)育期的表達(dá)，同時(shí)也顯著抑制了在同時(shí)期的表達(dá)，且它們的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，表明GA處理促進(jìn)了vvi-miR160a/b對(duì)的負(fù)調(diào)控作用；相反，GA減弱了vvi-miR160c/d/e對(duì)的負(fù)調(diào)控作用。在vvi-miR160家族中，vvi-miR160c/d/e可能介導(dǎo)在葡萄種子發(fā)育的特定階段調(diào)控種子的發(fā)育形成，而vvi-miR160a/b可能主要介導(dǎo)參與調(diào)控GA誘導(dǎo)葡萄種子敗育的過程。

葡萄；vvi-miR160s；；GA；種子發(fā)育

0 引言

【研究意義】MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為19—24個(gè)核苷酸的非編碼RNA序列，其主要通過特異性切割或抑制靶mRNA的翻譯調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[1-2]，在植物的多種生理代謝過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]、生長(zhǎng)發(fā)育[5]和非生物脅迫[6]等。植物中已經(jīng)鑒定了許多miRNA家族，其中microR160家族比較保守，其在調(diào)節(jié)植物形態(tài)[7]，增強(qiáng)植物抗性[8]，調(diào)節(jié)花和胚胎的發(fā)育[9-10]，影響植物體內(nèi)激素含量的變化[11]等過程中起著重要作用。到目前為止，miR160及其靶基因功能的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)方面，筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)葡萄miR160（vvi-miR160s）及其靶基因可能參與單性結(jié)實(shí)發(fā)育的調(diào)控，而對(duì)漿果發(fā)育，尤其是在果核發(fā)育方面尚未見報(bào)道。因此，開展miR160及其靶基因?qū)ζ咸压税l(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究，對(duì)闡釋葡萄果實(shí)核發(fā)育機(jī)制以及無核育種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)miR160主要靶向生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF（Auxin response factor，ARF）轉(zhuǎn)錄因子，其主要調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)[12]，能夠與生長(zhǎng)素基因啟動(dòng)子中的TGTCTC序列特異性結(jié)合，激活或抑制相關(guān)基因的表達(dá)[13]。目前，ARF家族已經(jīng)在番茄、擬南芥、蘋果、柑橘、大豆、黃瓜、谷子、白菜等作物中得到鑒定[14]。番茄miR160a通過抑制靶基因，影響葉片生長(zhǎng)[15]；擬南芥miR160負(fù)調(diào)控靶基因，參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)[11]。擬南芥miR160還可負(fù)調(diào)控靶基因和，通過ABA途徑參與種子的萌發(fā)和休眠[16]。近期研究發(fā)現(xiàn)，ARF是生長(zhǎng)素與赤霉素信號(hào)途徑的交互作用因子。通過降低番茄mRNA水平可能影響GA信號(hào)通路，且僅調(diào)控番茄果實(shí)坐果及其相關(guān)的生長(zhǎng)素信號(hào)通路[17]。例如，在擬南芥中，生長(zhǎng)素處理導(dǎo)致AUX/IAA和ARF蛋白可直接調(diào)節(jié)GA代謝基因的表達(dá)，并且該結(jié)果與生長(zhǎng)素過表達(dá)突變體相同[18]。此外，擬南芥胚珠受精可引發(fā)生長(zhǎng)素介導(dǎo)的GA生物合成[19]。盡管如此，有關(guān)ARFs調(diào)控植物種子發(fā)育的研究尚未見報(bào)道。葡萄（. L）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其栽培面積和產(chǎn)量?jī)H次于柑橘，位居世界第二。葡萄是赤霉素（GA）高度敏感型果樹，外源GA處理極易誘導(dǎo)葡萄無核或殘核；另一方面，GA也可調(diào)控葡萄種子發(fā)育從而影響果實(shí)大小。盡管GA被廣泛應(yīng)用于葡萄無核生產(chǎn)或種子發(fā)育調(diào)控，但其分子機(jī)制尚不清晰。【本研究切入點(diǎn)】基因組測(cè)序使葡萄基因組中vvi-miR160s成熟體精確序列的鑒定及進(jìn)化分析成為可能，但其對(duì)靶基因的裂解作用，以及它們?cè)贕A介導(dǎo)的葡萄果實(shí)發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)模式尚無報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】鑒定‘魏可’葡萄中vvi-miR160家族成員的精確序列，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證其靶基因，分析其序列特征及其潛在功能，鑒定它們?cè)谄咸逊N子發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)特征及其應(yīng)答GA的模式，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)vvi-miR160s及其靶基因在種子發(fā)育過程中的作用提供重要信息，同時(shí)也為GA誘導(dǎo)果實(shí)無核過程提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄科研基地進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

以5年生歐亞種葡萄‘魏可’為材料。選取生長(zhǎng)勢(shì)基本一致的花序，根據(jù)前人研究結(jié)果，以50 mg?L-1赤霉素溶液（含0.2%吐溫），于盛花前9 d浸沾花穗30 s，以清水為對(duì)照，分別在花后2、5、10、20、30和40 d采集樣品，一部分用于體式顯微鏡觀察，另一部分分離果皮、果肉、種子，凍存于液氮后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 vvi-miR160s成熟體序列克隆鑒定 在miRBase 22.1數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.mirbase.org/）中搜索不同物種miR160s的成熟體序列，基于葡萄miR160s成熟體序列，利用miR-RACE在‘魏可’種子中克隆其成熟體序列，測(cè)序鑒定其精準(zhǔn)序列[20]，并在葡萄基因組中比對(duì)葡萄miR160s前體基因（）。使用在線軟件Primer3 Input（http:// bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)引物（表1），以‘魏可’葡萄總DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增（95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min），產(chǎn)物經(jīng)電泳回收，送公司測(cè)序。利用在線軟件RNA Folding Form（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）分析前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)；利用軟件MapInsepet進(jìn)行染色體位置的繪制。

1.2.2 vvi-miR160s靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析 運(yùn)用在線軟件PSRNA Target（http://plantgrn.noble.org/ v1_psRNATarget/#）預(yù)測(cè)vvi-miR160s的靶基因。運(yùn)用在線軟件ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）分析VvARF18蛋白的分子式、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸含量、不穩(wěn)定指數(shù)、親疏水性；在線軟件NCBI Conserved Domain Serch（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析VvARF18蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；在線軟件NLS Mapper（http://nls-mapper. iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）進(jìn)行核定位信號(hào)分析；Genscript（https://www.genscript.com/ wolf-psort.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。利用NCBI- BLAST尋找VvARF18蛋白的同原序列，并用MEGA 6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用在線軟件GSDS（http:// gsds.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行不同物種基因結(jié)構(gòu)構(gòu)建；在線軟件MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）進(jìn)行不同物種作用元件motif分析；在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子作用元件分析。

1.2.3啟動(dòng)子順式作用元件分析 在Grape Genome Browser（http://www.genoscope.cns.fr/externe/ GenomeBrowser/Vitis/）數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找轉(zhuǎn)錄起始位置上游1 500 bp序列，即啟動(dòng)子序列，將啟動(dòng)子序列放入在線數(shù)據(jù)庫(kù)Plant CARE中，尋找相對(duì)應(yīng)的作用元件。

1.2.4 vvi-miR160s及其靶基因在葡萄果核發(fā)育過程中的表達(dá)分析 采用CTAB法提取葡萄種子總RNA，并使用abm試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)定量引物設(shè)計(jì)的原則，利用Primer3 Input（http://bioinfo.ut. ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)vvi-miR160家族以及的定量引物（表2）。

表1 VvMIR160sPCR擴(kuò)增引物序列

按照SYPBR Premix ExTaqTM試劑盒（寶生物工程有限公司）指導(dǎo)，采用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增體系為20 μL（1 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，10 μL 2×TransStart Tip GreenqPCR SuperMix，8.2 μL ddH20）。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 30 s；94℃5 s，60℃15 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。葡萄（XM002273532）為內(nèi)參基因，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 22.0進(jìn)行方差分析，使用Origin 9軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 GA處理對(duì)‘魏可’葡萄果核發(fā)育的影響

本試驗(yàn)通過花前赤霉素（GA）處理發(fā)現(xiàn)，花后2 d時(shí)，對(duì)照組和GA處理組均有胚珠，但是對(duì)照比GA處理組的胚珠大；到花后5 d時(shí)，對(duì)照組可明顯觀察到胚珠，而GA處理組胚珠發(fā)育不良，逐漸退化、縮小；在花后10、20、30和40 d中，對(duì)照組中胚珠逐漸發(fā)育成成熟種子，而GA處理組胚珠退化、消失，導(dǎo)致果實(shí)無核，僅可以觀察到木質(zhì)化的細(xì)線（圖1-A）。除此之外，GA處理還增大果實(shí)縱經(jīng)、減小果實(shí)橫徑，增大果形指數(shù)（圖1-B）。以上結(jié)果表明，GA可以抑制葡萄果實(shí)胚珠及種子的發(fā)育，從而誘導(dǎo)果實(shí)無核，同時(shí)影響果實(shí)形狀。

2.2 vvi-miR160s序列鑒定及前體基因擴(kuò)增

采用miR-RACE技術(shù)，鑒定葡萄中vvi-miR160s成員的精確序列。vvi-miR160s成員的3′和5′-miR- RACE的產(chǎn)物分別為88 bp和62 bp（圖2-A），且該序列與miRBase22.1數(shù)據(jù)庫(kù)中所上傳的序列一致。以‘魏可’葡萄總DNA為模板，對(duì)vvi-miR160s的前體基因進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)凝膠電泳后獲得5條約501 bp的特異性條帶，并且沒有非特異性雜帶。經(jīng)純化、測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，其前體基因序列均為501 bp（圖2-B）。

圖1 GA處理對(duì)‘魏可’葡萄果實(shí)發(fā)育的影響

Fig. 1 Effect of GA treatment on fruit development of Wink grape

表2 vvi-miR160s及VvARF18定量引物序列

圖2 vvi-miR160s成熟體序列分析和染色體分布

其中，vvi-miR160a/b成熟體序列為23 bp，而vvi-miR160c/d/e的序列長(zhǎng)度為21 bp；vvi-miR160s成熟體序列保守程度較高，其中vvi-miR160a、b相同，vvi-miR160c、d、e序列相同；而vvi-miR160s互補(bǔ)序列的保守度較低（圖2-C）。vvi-miR160s成員分別分布在染色體12（vvi-miR160a）、染色體10（vvi-miR160b和vvi-miR160c）、染色體8（vvi-miR160d）和染色體13（vvi-miR160e）上，其中vvi-miR160a和b成熟體序列相同，但卻分布在不同染色體上，而vvi-miR160b和c成熟體序列不同，卻分布在相同的染色體上，表明成熟體序列保守的miRNA在染色體上位置并不一定保守；通過在線軟件RNA Folding Form分析可知，vvi-miR160s前體序列均可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這為VvmiRNAs穩(wěn)定存在提供了有力的證據(jù)（圖2-D）。

2.3 VvMIR160s前體基因的進(jìn)化分析與成熟體序列比對(duì)

利用MEGA6.0軟件對(duì)擬南芥（）、煙草（）、番茄（）、毛果楊（）、水稻（）等17種植物的miR160家族進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析以及成熟體序列比對(duì)（圖3）。結(jié)果表明，不同物種miR160家族成員數(shù)量不同，小麥（）、棉花（）、花生（）、向日葵（）等物種中miR160家族成員僅有1個(gè)，而水稻（6個(gè)）（）、煙草（4個(gè)）（）、高粱（6個(gè)）（）、蘋果（5個(gè)）（）、毛果楊（8個(gè)）（）等物種的miR160家族成員較多；除vvi-miR160a/b外，其余物種miR160家族成員成熟體序列為21個(gè)堿基。并且從進(jìn)化圖譜和成熟體序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，vvi-miR160c/d/e與小麥、草莓（）、玉米（）、高粱、水稻等物種的親緣關(guān)系較進(jìn)，且成熟體序列相同；與向日葵、柑橘（）等物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且成熟體序列間存在差異，而vvi-miR160a/b與毛果楊ptc-miR160e/ f/g/h、煙草nta-miR160d、甜瓜cme-miR160d親緣關(guān)系較進(jìn)，且成熟體序列相同，但值得注意的是，vvi-miR160s成員與棉花成熟體序列的差異較大，僅有9個(gè)堿基完全匹配。綜上所述，盡管不同物種miR160家族成員保守性較高，但仍存在個(gè)別物種間miR160家族成員存在一定的差異，表明其序列存在較高保守性的同時(shí)也具有一定的進(jìn)化多樣性。

2.4 vvi-miR160s靶基因的預(yù)測(cè)

利用在線軟件psRNATarget預(yù)測(cè)vvi-miR160s的靶基因（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，vvi-miR160家族不同成員均有相同的靶基因（VIT213s0019g04380）、（VIT218s0001g04180）、（VIT208s0040g01810）。其中，vvi-miR160s與的錯(cuò)配率為2.5，與和的錯(cuò)配率為3。鑒于前期已有vvi-miR160s靶基因和的研究[21]，因此，本研究重點(diǎn)對(duì)錯(cuò)配率最低的靶基因開展研究，分析vvi-miR160s介導(dǎo)的調(diào)控作用。

×：錯(cuò)配為1，○：錯(cuò)配為0.5

2.5 靶基因VvARF18的序列及潛在功能分析

2.5.1序列結(jié)構(gòu)分析共編碼683個(gè)氨基酸。VvARF18蛋白分子式為C3327H5169N939O1003S28，分子質(zhì)量為75 268.01 Da，理論等電點(diǎn)pI為6.43；丙氨酸的含量最高為9.5%，其次為亮氨酸占8.9%，最低為色氨酸，僅1.6%；不穩(wěn)定指數(shù)48.84，為不穩(wěn)定蛋白（40以下為穩(wěn)定蛋白），總平均輸水指數(shù)為-0.388，表明其為親水性蛋白。VvARF18蛋白有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為B3結(jié)構(gòu)域（117—218位氨基酸）、生長(zhǎng)素響應(yīng)結(jié)構(gòu)域（279—362位氨基酸）和AUX-IAA結(jié)構(gòu)域（604—681位氨基酸）。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，蛋白的第398—411位存在核定位信號(hào)（PPRKKLRLQQQSEF）（圖5-A）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果也表明，其主要定位于細(xì)胞核上。

通過基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，不同植物中的內(nèi)含子數(shù)量從2—4個(gè)不等（圖5-B），其中葡萄與榴蓮（）、龍眼（）、番木瓜（）、草莓、茶（）、橡膠樹（）基因結(jié)構(gòu)相似（均含有2個(gè)內(nèi)含子、3個(gè)外顯子），且每個(gè)外顯子長(zhǎng)度和分布相似，而內(nèi)含子長(zhǎng)度差異較大。特殊的是，煙草沒有5′ UTR序列。這些結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)較為保守，但在進(jìn)化的過程中表現(xiàn)出一定的多樣性。

2.5.2 ARF18蛋白進(jìn)化分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)葡萄ARF18蛋白序列進(jìn)行同源比較，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VvARF18蛋白與茶、煙草、梅花等物種的親緣關(guān)系較進(jìn)，與毛白楊、番木瓜、甜櫻桃、草莓等物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5.3 ARF18蛋白作用元件分析 利用在線軟件MEME對(duì)ARF18蛋白進(jìn)行作用元件motif分析（圖7）。結(jié)果表明，VvARF18蛋白和其他14個(gè)物種ARF蛋白作用元件的數(shù)量和排列順序完全相同，且這15個(gè)motif作用元件保守性也非常高，表明VvARF18蛋白與其他物種氨基酸序列保守性較高，功能相似。

圖5 ARF序列結(jié)構(gòu)分析

圖6 ARF18蛋白進(jìn)化分析

圖7 ARF18蛋白作用元件

2.6 VvARF18啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用在線軟件Plant CARE對(duì)啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，在啟動(dòng)子中，除了含有基本的作用元件CAAT-box、TATA-box外，其余作用元件可以分為4類：光響應(yīng)作用元件如3-AF1 binding site、AE-box、Box 4、G-box、GT1-motif；脅迫相關(guān)作用元件如厭氧誘導(dǎo)元件（ARE）、低溫誘導(dǎo)元件（LRT）；而MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)（CCAAT-box）和MYB參與干旱誘導(dǎo)位點(diǎn)（MBS）；在激素類響應(yīng)元件中，有較多的激素類型，如脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxRR-core）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）以及赤霉素響應(yīng)元件（P-box）（表3），由此推測(cè)可能參與不同激素信號(hào)通路。

表3 VvARF18基因啟動(dòng)子順式作用元件

2.7 vvi-miR160s及其靶基因裂解驗(yàn)證

鑒于植物miRNA主要通過介導(dǎo)靶基因的裂解調(diào)控靶基因的表達(dá)，本研究利用5′-RLM-RACE和3′-PPM- RACE技術(shù)驗(yàn)證vvi-miR160s的靶基因。RLM-RACE結(jié)果表明（圖8），vvi-miR160a/b和vvi- miR160c/d/e均可裂解，裂解位點(diǎn)位于miRNA 5′端的第10位，且裂解頻度為9/17；PPM-RACE結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，vvi-miR160s均可裂解靶基因，其裂解位點(diǎn)相同于RLM-RACE結(jié)果，裂解頻度為3/20，顯著低于RLM-RACE結(jié)果，這可能是由于5′末端的裂解產(chǎn)物比3′末端產(chǎn)物更容易降解。該試驗(yàn)結(jié)果證明了是vvi-miR160s家族真實(shí)的靶基因。

圖8 vvi-miR160s及其靶基因裂解驗(yàn)證

2.8 vvi-miR160s和VvARF18在葡萄種子發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)模式及其相關(guān)性

在葡萄種子發(fā)育過程中，vvi-miR160a/b的表達(dá)量在花后2—10 d呈上升趨勢(shì)，而在20—40 d時(shí)，表達(dá)量較低，幾乎不表達(dá)；vvi-miR160c/d/e的表達(dá)量在種子發(fā)育的整個(gè)時(shí)期呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，并且在花后20 d時(shí)，表達(dá)量最低；而在種子發(fā)育的過程中呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，并在花后10 d表達(dá)量最高（圖9-A）。

對(duì)比vvi-miR160s和的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)vvi-miR160c/d/e與靶基因呈現(xiàn)比較顯著的負(fù)相關(guān)，而vvi-miR160a/b與之間相關(guān)性較差（圖9-B），表明在葡萄種子發(fā)育過程中，vvi-miR160家族可能主要通過vvi-miR160c/d/e介導(dǎo)起調(diào)控作用，而vvi-miR160a/b在葡萄種子發(fā)育過程的調(diào)控作用可能較弱。

2.9 vvi-miR160s和VvARF18響應(yīng)GA的時(shí)空表達(dá)模式及其相關(guān)性

通過外源赤霉素處理，研究vvi-miR160s及其靶基因?qū)ζ咸逊N子發(fā)育的影響（圖10-A）。結(jié)果表明，赤霉素處理使vvi-miR160a/b的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，尤其在花后20—40 d，表達(dá)差異達(dá)到極顯著水平；相比之下，赤霉素處理對(duì)vvi-miR160c/d/e表達(dá)的影響并不太顯著。有趣的是，赤霉素處理卻顯著上調(diào)了靶基因在花后2—5 d葡萄胚珠中的表達(dá)，而在花后10—40 d，的表達(dá)卻被顯著下調(diào)。對(duì)比赤霉素處理后vvi-miR160s與表達(dá)水平的相關(guān)性（圖10-B），發(fā)現(xiàn)在赤霉素處理誘導(dǎo)葡萄種子敗育過程中，赤霉素處理誘導(dǎo)了vvi-miR160a/b與表達(dá)水平的負(fù)相關(guān)，卻減弱了vvi-miR160c/d/e與表達(dá)水平的負(fù)相關(guān)，表明GA增強(qiáng)了vvi-miR160a/b對(duì)的負(fù)調(diào)控作用，卻減弱了vvi-miR160c/d/e對(duì)的負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)也表明在vvi-miR160家族中，vvi-miR160a/b可能是主要應(yīng)答GA介導(dǎo)葡萄種子敗育的調(diào)控因子。

圖9 vvi-miR160s：VvARF18時(shí)空表達(dá)模式及其相關(guān)性

圖10 vvi-miR160s和VvARF18響應(yīng)GA在葡萄種子發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)分析

3 討論

研究表明，施用外源GA對(duì)花發(fā)育，葡萄果實(shí)膨大、成熟以及無核化具有重要的影響[21-23]。然而，GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的葡萄果實(shí)種子敗育的分子機(jī)制尚不清楚。近年來，microRNA通過間接或直接轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄基因沉默調(diào)節(jié)基因網(wǎng)絡(luò)在各種發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)中的活性，被鑒定為基因表達(dá)的關(guān)鍵因子[24-26]。例如，擬南芥miR160負(fù)調(diào)控靶基因和，參與ABA途徑調(diào)控種子的萌發(fā)和休眠[19]；同時(shí)，miR160和miR166/165還參與了擬南芥體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)中LEC2介導(dǎo)的生長(zhǎng)素反應(yīng)[10]。筆者課題組前期研究揭示，外源GA的應(yīng)用誘導(dǎo)了參與果實(shí)發(fā)育的microRNA家族的表達(dá)，如miR397[27]和miR156[28]。在本試驗(yàn)中，利用vvi-miR160s-研究GA介導(dǎo)葡萄果實(shí)發(fā)育的調(diào)節(jié)功能，發(fā)現(xiàn)GA可以抑制葡萄果實(shí)胚珠及種子的發(fā)育，從而誘導(dǎo)果實(shí)無核化，同時(shí)影響果實(shí)形狀。本研究與王文然等[27]的研究結(jié)果一致，證實(shí)GA信號(hào)傳導(dǎo)是葡萄果實(shí)無核化的重要調(diào)控因素。

MicroRNA基因家族的進(jìn)化分析對(duì)全面闡述miRNA的功能具有重要作用。隨著miRNA測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步以及基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，許多物種中miRNA160家族不斷被挖掘，如蘋果[29]、柑橘[30]、草莓[31]等，并且不同物種中miR160s是一個(gè)多拷貝基因家族，具有高度保守性。基于之前對(duì)GA誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實(shí)的microRNA測(cè)序[32]，本研究精確鑒定了vvi-miR160s家族的序列，同時(shí)比對(duì)了不同物種間miR160家族的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在不同物種間miR160s成熟體序列有9個(gè)氨基酸高度保守，但是在棉花miR160與其他miR160家族存在較大差異，說明miR160序列存在較高保守性的同時(shí)也具有一定的進(jìn)化多樣性。

ARF18進(jìn)化樹分析表明，VvARF18與茶ARF18親緣關(guān)系最近，并且兩者的基因結(jié)構(gòu)相同，均含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，同時(shí)蛋白作用元件分析表明，兩者含有的作用元件數(shù)量和排列順序完全相同，說明VvARF18蛋白和茶ARF18蛋白具有相似的功能，進(jìn)一步表明不同物種間ARF18蛋白高度保守性。啟動(dòng)子順式作用元件分析表明，其含有較多的光、激素響應(yīng)元件。前期研究發(fā)現(xiàn)miR160s中同樣含有較多激素響應(yīng)元件[21]，表明vvi-miR160s和共同參與葡萄果實(shí)發(fā)育過程中激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

MiRNA家族的多個(gè)成員及其靶基因可以形成具有一些冗余或互補(bǔ)功能的miRNA介導(dǎo)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，并且不同的miRNA家族成員具有不同的時(shí)空表達(dá)模式[33]。研究表明，水稻花藥的早期發(fā)育[34]、杏種子SASK的生物合成[35]及甜菜響應(yīng)鹽脅迫[36]等過程，均通過miR160負(fù)調(diào)控其靶基因?qū)崿F(xiàn)。同樣，本研究也表明，在葡萄種子發(fā)育過程中，vvi-miR160家族可能主要通過vvi-miR160c/d/e介導(dǎo)靶基因起調(diào)控作用。此外，在擬南芥中，ath-miR160a通過負(fù)調(diào)控影響胚胎的發(fā)育[37]。番茄miR160通過靶向進(jìn)而影響番茄的花器官脫落和子房異常等各個(gè)方面[38]，且番茄sly-miR160敲除使植物表現(xiàn)出異常的子房和花器官脫落。本研究發(fā)現(xiàn)，GA增強(qiáng)了vvi-miR160a/b對(duì)的負(fù)調(diào)控作用，卻減弱了vvi-miR160c/d/e對(duì)的負(fù)調(diào)控作用，表明在vvi-miR160s家族中，vvi-miR160a/b可能是主要應(yīng)答GA介導(dǎo)葡萄種子敗育的調(diào)控因子。這些都表明miR160可能介導(dǎo)參與調(diào)控植物子房及種子的發(fā)育本研究結(jié)果為進(jìn)一步開展vvi-miR160s及其靶基因如何響應(yīng)GA信號(hào)調(diào)控葡萄無核果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用miR-RACE技術(shù)鑒定了葡萄miR160成員的精確序列，預(yù)測(cè)到其靶基因；利用RLM-RACE技術(shù)檢測(cè)vvi-miR160s對(duì)其靶基因的裂解位點(diǎn)在第10和第11位之間，裂解頻度9/17。在vvi-miR160家族中，vvi-miR160c/d/e可能介導(dǎo)在葡萄種子發(fā)育的特定階段調(diào)控種子的發(fā)育形成，而vvi-miR160a/b可能介導(dǎo)主要參與調(diào)控GA誘導(dǎo)葡萄種子敗育的過程。

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vvi-miR160s in MediatingResponse to Gibberellin Regulation of Grape Seed Development

Bai YunHe, Wang WenRan, Dong TianYu, Guan Le, Su ZiWen, Jia HaiFeng, Fang JingGui, Wang Chen

(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

【】This study was performed to investigate the roles and the modes responsive to gibberellin (GA) of the vvi-miR160 family and its target genes in the development of Wink grape seed. 【】 miR-RACE, RT-qPCR, bioinformatics and RLM-RACE were employed to identify vvi-miR160s and its target gene, and to analyze their modes responsive to GAof spatio-temporal expression and potential functions. 【】 GA treatment before flowering strongly inhibited the ovule and seed development of Wink grape and induced grape seedless berries with high efficiency, and the seedless rate of berries reached 99.8%. The precursor gene sequence (501 bp) and mature sequence of vvi-miR160s were cloned and identified, which were highly conserved across different plant species. The mature sequences of vvi-miR160s were used as queries to predict the target gene. The cleavage sites with 9/17 being their cleavage frequency of vvi-miR160s onwere detected between the 10th and 11th sites by RLM-RACE and PPM-RACE, which proved thatwas the true target gene of vvi-miR160s. VvARF18 encoded 683 amino acids, and a nuclear localization signal existed at positions 398-411, while the protein sub-cellular was localized on the nucleus. The homology of VvARF18 with other in other species was highly conserved. The VvARF18 protein was closely related to tea, tobacco, plum and other species. The number of elements and their order were the same across different species, and the genes structures were similar. Thepromoter contained four types of cis-elements, which possessed more hormone-related cis-elements. RT-qPCR analysis showed that vvi-miR160c/d/e showed a ‘V’-shaped expression trend with the development of grape berries, and the lowest expression levels were found during the stone-hardening stage.exhibited an opposite expression trend to the former, with the highest expression during stone-hardening stage, indicating that vvi-miR160c/d/e negatively regulates VvARF18, but there was no significant negative correlation between vvi-miR160a/b and VvARF18 expression levels. GA treatment significantly up-regulated the expression of vvi-miR160a/b in the development of grape hardcore seeds, and also conspicuously inhibited the expression ofunder GA treatments showed the typical negative correlation, indicating that GA treatment promoted the negative regulation of vvi-miR160a/b on; reversely, GA weakened the negative regulation of vvi-miR160c/d/e on.【】 Among the vvi-miR160 family, vvi-miR160c/d/e may mediated VvARF18 regulation of seed development during specific stages of grape seed development, whereas vvi-miR160a/b may mediated VvARF18, which might be mainly involved in the regulation of GA-induced grape seedless berry development.

grape; vvi-miR160s;; gibberellin (GA); seed development

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.015

2019-09-05；

2019-12-25

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20181318）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFD1000106）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31972373，31801809）

白云赫，E-mail：2017104028@njau.edu.cn。通信作者王晨，E-mail：wangchen@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）