清遠麻慢羽公雞的基因分型與生產性能研究

李華，方桂軍，華國洪，譚淑雯,3，張正芬，洪煜宇，于輝

清遠麻慢羽公雞的基因分型與生產性能研究

李華1,2，方桂軍1，華國洪2，譚淑雯1,3，張正芬2，洪煜宇1，于輝1,2

（1廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室/佛山科學技術學院，廣東佛山 528225；2廣東天農食品有限公司，廣東清遠 511827）

【】為了探討慢羽系中雜合子公雞基因分型準確率和構建無ev21基因抗病品系，探討育種群中慢羽公雞基因分型、慢羽中的微長型（L1）、倒長型（L2）、等長型（L3）、未出型（L4）4種表型以及與生產性能關系。另外，通過表達量的差異甄別快慢羽候選基因催乳素受體基因（PRLR）和精子鞭毛蛋白2（SPEF2）的可行性。采用PCR-RFLP對清遠麻慢羽公雞進行分子分型，通過后裔測定的測交方法驗證其分子分型的準確性，運用方差分析對各組別進行檢驗，采用百分數資料的t檢驗法比較各基因分型組別間對生產性能影響；利用RT-PCR 對快慢羽的候選基因進行定量分析，重點比較了快羽中的R2型與慢羽中的L2型和L4型的定量差異。568只慢羽公雞中，缺失體組（ev21-）占比41.73%，ev21+組占比為58.27%，其中純合子與雜合子分別占比為8.80%和49.47%；經測交驗證79只公雞后代，慢羽純合子和缺失體基因分型準確率為46.83%，基因分型雜合子實質為純合子。慢羽公雞中ev21+組其后代的等長型比率顯著高于ev21-組(≤0.05），ev21-組公雞的105日齡的通管性能極顯著高于ev21+組（≤0.01）。一日齡的雞，在R2對慢羽（L2+L4）中表達差異不顯著（＞0.05），但其表達量在R2與L4型對比中則下調，達到顯著水平（0.01＜≤0.05），而在慢羽中表達均極顯著高于快羽雞（≤0.01），其中與快羽R2 型比較，分別在未出型(L4）及倒長型（L2）中均上調表達，差異均達極顯著水平（≤0.01）。研究尚需探索出慢羽雜合子準確率高的基因分型新方法，慢羽雜合子公雞判別目前離不開現場測交驗證；可以組建無ev21基因抗病品系；需進一步探討造成ev21+組與ev21-組別間等長型比率以及羽毛成熟性差異的原因；一日齡的與均為影響快慢羽表型不同亞型差異的候選基因。

清遠麻公雞；慢羽；基因分型；生產性能

0 引言

【研究意義】快慢羽雜合子公雞的分子鑒別、慢羽雞缺失體抗病品系組建以及候選基因的甄別對家禽分子育種具有重要理論和應用價值，快慢羽品系生長和羽速差異對生產具有重要意義。【前人研究進展】快慢羽為伴性遺傳性狀，慢羽雞主尾羽短于快羽雞，邱祥聘等把快羽分為R1型（主翼羽長于覆主翼羽5mm以上）和R2型（主翼羽長于覆主翼羽2 mm而短于5 mm以內），慢羽分為微長型（主翼羽長于覆主翼羽在2mm以內，L1）、倒長型（主翼羽短于覆主翼羽，L2 ）、等長型（主翼羽與覆主翼羽等長，L3 )和未出型（主翼羽未長出或主翼羽與覆主翼羽均未長出，L4）[1]。快慢羽初生雛雞的雌雄鑒別已廣泛應用于生產，具有極大的市場價值，國內已廣泛開展了快慢羽的表型與生產性能的研究[2]，其中大部分研究為不同品種快慢羽品系不同階段對體重等生產性能有不同的影響[3-5]；有關快慢羽各亞型對生產性能的影響研究甚少，如尹華貴等研究了120日齡長型、微長型、等長型、短型、未出型5種不同羽型瀘州黃羽烏雞的體重之間并無顯著差異[3-6]。慢羽基因座K與內源性病毒21（ev21）基因緊密連鎖，可通過對ev21的插入與否檢測區分快慢羽，準確率一般達99% 左右[7-9]。對雜合慢羽公雞的鑒別，大多數育種場目前主要采用測交依據表型鑒別，對其分子鑒別處于探討階段，且尚無報道慢羽公雞以及其亞型分子檢測的準確性[10-14]。催乳激素受體基因()與精子鞭毛蛋白2（）是影響快慢羽的候選基因[15-16]，但后續的學者研究結論不一，如在一日齡杏花雞和文昌雞的慢羽翅膀皮膚中表達顯著高于快羽[15]，但此結論未在蘇禽綠殼蛋雞中得到支持[16]；同樣，在蘇禽綠殼蛋慢羽雞中表達顯著高于快羽[16]，但使用微陣列法分析認為在一日齡杏花雞翅膀皮膚中不表達[15]。【本研究切入點】慢羽公雞雜合子基因分型與測交判型比對其準確率，慢羽各亞型、分子分型與生產性能關系，快慢羽表型形成的候選基因和調控機制尚不清晰。【擬解決的關鍵問題】測交驗證慢羽公雞雜合子分子分型準確率，慢羽各表型、基因型與生產性能的關系；利用熒光定量PCR（RT-PCR）初步篩選快慢羽的候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗在廣東天農食品有限公司原種場進行，包括核心群慢羽純系M系和祖代慢羽公雞，飼養方式按照公司種雞飼養標準實施；按照《家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》在2014—2015年期間測定了105日齡的公雞冠高、體重、脛長、脛圍和通管值[17]。選取一日齡快羽型（R2）、慢羽中主翼羽與覆主翼羽均未長出羽毛的未出型（L4）和倒長型（L2）各6只雞，在佛山科學技術學院通過熒光定量PCR（RT-PCR）分析和的mRNA表達量。

1.2 慢羽公雞基因分型

在翅靜脈采集血樣，檸檬酸葡萄糖溶液（ACD）抗凝。采用北京艾德來生物科技有限公司提供的小量全血基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA后進行PCR擴增，采用Iraqi[7]等設計的引物和程序進行擴增，擴增產物用限制性內切酶（Ⅲ）進行酶切，酶切結果用1.5% 的瓊脂糖電泳進行檢測。

1.3 慢羽候選基因定量分析

采集翅膀皮膚，液氮研磨樣品，使用Trizol 法根據說明書提取翅膀皮膚總RNA。使用寶生物工程（大連）有限公司反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，分別進行反轉錄和定量。其中內參引物為：FGAG AAATTGTGCGTGACATCA，R為CCTGAACCTCTC ATTGCCA，定量引物為F:GCCCAGACTACAG AACATCA，R:GAGGATCCGAGCTGTTACTT，定量引物為F：ACACACCAGAACAGTGAAGC，R:A GGTCTGTAAAGGGCTGAAC，使用ABI 7500定量PCR 儀進行定量，退火溫度為57℃。

1.4 統計分析

試驗數據用Excel進行初步整理后，運用SPSS 18.0軟件進行組別間的單因素方差分析的LSD檢驗，并對兩兩樣本間的百分率進行t檢驗，基因的定量數據使用2- ΔΔCt方法進行分析。

2 結果

2.1 慢羽公雞酶切分型

清遠麻雞成年公雞的酶切分型結果表明（圖1）：純合子只有一條帶（1 450 bp），ev21缺失體有兩條帶（1 068 bp、382 bp）、雜合子有3條帶（1 450 bp、1 068 bp和382 bp）。由表1可知，檢測的568只慢羽公雞中純合子、缺失體和雜合子分別占總數的8.80%、41.73%和49.47%，其中慢羽純系中純合子10.09%、缺失體43.86%和雜合子46.05%；祖代純合子、缺失體和雜合子分別占比7.94%、40.29%和51.77%。總體來看，缺失體高達41.73%、純合子與雜合子占比分別為8.8%和49.74%。

M為Marker DL2 000；2為純合個體；5、8、9為雜合個體；1、3、4、6、7為ev21缺失個體

表1 慢羽系公雞分子分型

Table 1 Genotyping cocks of the late-feathering line

2.2 現場測交與基因分型比對

通過性能比較和家系分析，篩選了79只公雞進行繼代并測交，驗證分子檢測的準確性，核心群慢羽純系結果表明（表2）：出苗883只雞全部為慢羽，其中微長型11.78%（104只）、倒長型為62.74%（554只）、等長型7.70%（68只）和未出型17.78%（157只）。測交驗證基因分型為雜合子的42只公雞其后代無一表現為快羽，分子分型判型錯認為的雜合子實際為純合子（53.17%），慢羽純合子和缺失體基因分型準確率為46.83%；缺失體組（ev21-）占比高達41.77%，可以組建抗病品系。合并雜合子組和純合子組為有ev21插入組（ev21+），與缺失體組（ev21-）進行比較，僅ev21-組的等長型比率顯著低于ev21+組（0.01＜≤0.05），其余組間差異不顯著（＞0.05）。

2.3 慢羽公雞不同基因分型間生產性能的比較

對慢羽系核心群后備留種成年的慢羽公雞，分別檢測105日齡的平均體重、冠高、脛長和脛圍（表3），結果表明ev21-組通管性能優于ev21+組，達到差異極顯著水平（≤0.01），其余指標間差異均不顯著（＞0.05）。

表2 慢羽公雞測交的表型與分子分型比較

Table 2 Comparison of phenotypes and genotypes in late-feathering cocks by test cross

同列肩標無字母表示差異不顯著（＞0.05），標字母相鄰差異顯著（0.01＜≤0.05），標字母相間差異極顯著（≤0.01）。下同

Values in the same column with no letter indicate not significant difference (＞0.05); Values in the same column with adjacent letters was significant difference (0.01＜≤0.05); Values in the same column with interphase letters was highly significant difference (≤0.01). Same as below

表3 105日齡慢羽公雞生產性能的比較

2.4 候選基因定量表達分析

以一日齡慢羽型（L2+L4）為對照，在快羽R2 型中極顯著下調（≤0.01），而表達差異不顯著（＞0.05）。在快慢羽各亞型比較中，以未出型（L4）作為對照，和在倒長型（L2）中均表達差異不顯著（＞0.05），和均分別在快羽R2型中顯著低表達，分別達到顯著（0.01＜≤0.05）和極顯著差異水平（≤0.01）；與慢羽L2 型相比，在快羽R2型中極顯著低表達（≤0.01，圖2）。

3 討論

3.1 分子檢測分型的準確性

本試驗所有慢羽系的公雞已經通過多個世代的現場測交早已純化[7, 9]，但基因分型結果與現場測交選育并不吻合，基因分型鑒定出為雜合子的公雞，現場測交驗證為純合子，因此，基因分型準確率僅為46.83%，本試驗首次通過分子分型結合測交驗證種公雞雜合子的準確率。李競一等[10]運用相同的方法對大午種禽有限公司商品代慢羽公雞進行鑒別，準確率達到95.45%，由于只是商品代，并未進行測交驗證其雜合性；李珊珊等[13]對麒麟公雞同理鑒別了高比例的慢羽雜合公雞，并通過短片段的測序支持分子分型的結果，但未通過測交驗證。近期TAKENOUCHI等[12]通過多品種的研究，表明ev21插入并非是導致慢羽的原因。因此，只有探明慢羽形成的真實基因，才能破解理論與實踐脫節的難題。清遠麻雞慢羽缺失型高比例支持了課題組前幾個世代的報道[11]，這為組建高免疫應答的抗病性品系打下了基礎。

A以慢羽型（L2+L4）為對照；B以未出型（L4）為對照；同基因標字母相同表示差異不顯著（P＞0.05），標字母相鄰差異顯著（0.01＜P≤0.05），標字母相間差異極顯著（P≤0.01）

現場選育中，慢羽四種表型一般選留倒長型和等長型，剔除主翼羽和覆主翼羽均未長出的未出型和相對難以區分的微長型。本試驗首次將慢羽不同基因分型與慢羽4種亞表型結合深度解析，表明無ev21組插入的慢羽公雞的后代依然以倒長型最多，未出型和等長型次之，微長型最少，這與朱慶等的結果相一致[18]。ev21+組與ev21-組比較，僅ev21-組的等長型比率顯著低于ev21+組（≤0.05），這表明了ev21插入對等長型羽速生長有一定影響，但其他亞型影響卻不顯著，究竟是什么分子調控機制造成這種差異，值得進一步研究。ELFERINK等[19]對K座位的分子結構研究表明了K座位中的ev21結合位點不是和K座位連鎖，而是ev21插入其中間的非翻譯區，本研究所找到的ev21缺失個體，是2個URa所在的區域發生了缺失，還是K座位內部發生了重組，還有待測序進一步研究。李珊珊[13]通過短片段的雜合子與純合子測序發現有明顯差異，但測交結果已經否定了基于此方法建立的雜合子分型的準確性。雞Z染色體上慢羽基因位點大致在9 607 480—10 607 757 bp處，且9 966 364—10 142 688 bp 基因組的復制導致了慢羽表型，值得進一步從大范圍的測序和功能分析去洞悉[20-22]。基于近期慢羽的新分型方法的研究，有待于進一步在各快慢羽各亞型中實施和驗證[14]。值得注意的是，謝后清等[23]1985年最早報道慢羽微長型細分為主微長型和覆微長型，除了、、、互作調控以及與ev21基因插入有關外[15-16,21,24]，通過對慢羽的未出型與倒長型分別與快羽的R2型的研究結果表明，快慢羽的調控與常染色體基因、miRNA和LncRNA等調控有關[22,25-26]，今后尚需要進一步從胚胎和生后階段從不同亞型和組學探討快慢羽差異[27-29]，設計更為嚴密的試驗闡述羽毛的發育與調控。

3.2 慢羽公雞不同分型對生產性能的影響

早期的研究主要集中在不同日齡的快慢羽系對生產性能的影響[2]，本試驗首次揭示了不同慢羽公雞基因分型對105日齡的體重、冠高、脛長和脛圍生產性能無影響（＞0.05），但ev21-組通管性能優于ev21+組，達到差異極顯著水平（≤0.01），說明建立ev21-品系利于通管，尚需要進一步探討其通管機制的差異[26]。此外，早前報道ev21的存在與禽白血病病毒（ALV）的免疫應答的降低有關，與慢羽雞感染外源性白血病毒后，其病毒血癥的發生率升高，引起產蛋下降和高死亡率有關[27]。因此，育成無ev21 基因的慢羽品系利于免疫和羽毛早熟，意義重大。

3.3 候選基因定量表達分析

和位于快慢羽等位基因座K上，被認為是快慢表型形成的候選基因。在慢羽的杏花雞和文昌雞中，其表達顯著高于快羽，在快慢羽中表達無差異[15]。本研究卻發現初生時R2與L4型中的R基因表達差異顯著（0.01＜≤0.05），但以一日齡慢羽型（L2+L4）為對照時，快慢羽表達差異卻不顯著（＞0.05）。表明參與了羽速發育[15]，但在快慢羽不同亞型中由于表達量差異而有所不同，尚需要針對不同快慢羽亞型進行具體分析。在慢羽各亞型中表達極顯著高于快羽雞，這與在蘇秦綠殼蛋雞中結論相似[16]。因此，認為和P均可作為快慢羽不同表型的各亞型在一日齡具有顯著差異的候選基因。鑒于雞不同部位的羽毛其進化和發育不一致，且具有胚胎期和生后期的時空表達差異，對快慢羽分子作用機制尚待進一步深入解析[24,28-32]。

4 結論

慢羽雜合子公雞基因分型目前不能替代測交，雜合子公雞選育判別必須借鑒現場測交，但慢羽公雞基因分型可為組建無ev21基因抗病品系打下基礎。本試驗僅ev21-組的等長型比率顯著低于ev21+組（0.01＜≤0.05），ev21-組通管性能優于ev21+組，達到差異極顯著水平（≤0.01），其余組間差異均不顯著（＞0.05）。一日齡的和均可作為鑒別快慢羽表型的候選基因，但其在不同慢羽亞型和生理階段的作用還需進一步解析。

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Study of Genotyping and Performance in Late-Feathering Qingyuan Partridge Cocks

LI Hua1,2, FANG GuiJun1, HUA GuoHong2, TAN ShuWen1,3, ZHANG ZhengFen2, HONG YuYu1,YU Hui1,2

(1Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precise Breeding/Foshan University, Foshan 528225, Guangdong;2Guangdong Tinoo’s Foods Corporation Ltd., Qingyuan 511827, Guangdong)

【】In order to verify the genotyping accuracy of heterozygotic cocks, and to construct the resistant strain without ev21 gene, the relationship among genotypes, four late-feathering sub-phenotypes (named micro-type as L1, inverted type as L2, isometric type as L3, and ungrown type as L4) and the production performance were investigated in the late-feathering Qingyuan partridge cocks. The feasibility was demonstrated by the expression profile difference of two candidate genes, i.e.,() and(), between the early- and late-feathering Qingyuan partridge cocks. 【】Genotypes were detected by PCR-RFLP in the late-feathering Qingyuan partridge cocks, and its accuracy was verified by progeny testing using a test cross. The production differences among genotyping groups were compared by variance analysis of percentage data and t-test. The expressions of two candidate genes were quantified by real-time quantitative PCR (RT-PCR) in both the early (R2) feathering and late (L2 and L4) feathering cocks. 【】Among the 568 late-feathering cocks, the proportion of the deletant group (ev21-group) was 41.73%, and that of the ev21+ group was 58.27%, of which the homozygotes and the heterozygote accounted for 8.80% and 49.47%, respectively. By the test cross, the genotyping accuracy was 46.83% both in the homozygote group and the deletant group, indicating that the heterozygote was in fact homozygote. The descendant percentage of the isometric late-feathering type in ev21+group was significantly higher than that in ev21-group (≤0.05). The feather maturity of the late-feathering cocks at 105-day-old in the ev21-group was extremely significantly higher than that in ev21+group (≤0.01). At one-day-old chicks, the expression ofgene between R2 versus (L2+L4) showed no any difference (＞0.05)，but its expression between R2 versus L4 was significantly down-regulated (0.01＜≤0.05). While the expression ofgene in late-feathering chickens was extremely significantly higher than that in early-feathering chickens (≤0.01). By comparing with the R2 group,significantly differentially up-regulated in the L4 and L2 groups (≤0.01). 【】New genotyping method should be developed for improving the accuracy of the heterozygote in the late feathering cocks. Up to now, a test cross is essential for the chicken production. Construction of the ev21-resistant strain is viable in late-feathering chicken breeding. Furthermore, studies need to be conducted to figure out the difference of isometric subtype ratio and feather maturity between the ev21+group and the ev21-group. Besides,were candidate genes for subtypes affecting the difference of early-feathering and late-feathering chickens at 1-day-old.

Qingyuan partridge cocks; late-feathering; genotyping; performance

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.017

2017-11-15；

2020-03-11

國家科技支撐計劃（2015BAD03B00）、廣東省科技項目（2016B020233007，2017-1649）、廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室（2019B030301010）、清遠市產學研合作項目（2018B02）

李華，E-mail：okhuali@fosu.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）