大豆巢式關聯作圖群體蛋白質含量的遺傳解析

李曙光，曹永策，賀建波，王吳彬，邢光南，楊加銀，趙團結，蓋鈞鎰

大豆巢式關聯作圖群體蛋白質含量的遺傳解析

李曙光1,2，曹永策1，賀建波1，王吳彬1，邢光南1，楊加銀2，趙團結1，蓋鈞鎰1

（1南京農業大學大豆研究所/國家大豆改良中心/農業部大豆生物學與遺傳育種重點實驗室/作物遺傳與種質創新國家重點實驗室/江蘇省現代作物生產協同創新中心，南京 210095；2江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所，江蘇淮安 223001）

【】大豆是重要的經濟作物，是人類植物蛋白質和油脂的主要來源。蛋白質含量作為大豆育種的主要目標之一，屬于多基因控制的復雜數量性狀，并且受環境條件的影響。通過對大豆巢式關聯作圖群體的蛋白質含量進行全基因組關聯分析，解析其遺傳構成，為高蛋白質含量的大豆品種育種提供理論基礎。以蒙8206為共同親本，對臨河×蒙8206、正陽×蒙8206、蒙8206×通山與蒙8206×WSB分別雜交，通過單粒傳法自交7代衍生的4個重組自交系群體，共計623個家系，整合為一個大豆巢式關聯作圖群體，利用RAD-seq技術進行SNP標記基因分型，并于2012年至2014年將該群體種植在5個不同田間環境，在大豆完熟期R8時測定蛋白質含量，利用限制性兩階段多位點全基因組關聯分析方法（RTM-GWAS）來解析蛋白質含量的遺傳構成。試驗群體的蛋白質含量變異較大，蛋白質含量性狀遺傳率較高，遺傳變異可解釋85.00%的表型變異。多環境聯合方差分析表明，蛋白質含量的基因型、環境以及基因型×環境均達到差異極顯著水平。全基因組關聯分析共檢測到90個蛋白質含量QTL，其中新檢測到20個QTL，每個QTL的表型變異解釋率為0.06%—3.99%，貢獻率總和為45.60%。每個QTL包含2—5個等位變異，等位變異效應為-2.434%—2.845%，大多數等位變異效應為-1.000%—1.000%，表明大多數等位變異的效應較小。根據檢測的90個蛋白質含量QTL，預測了73個蛋白質含量相關基因，其中參與甘氨酸與芳香族氨基酸代謝，參與半胱氨酸生物合成，推測其為重要蛋白質含量候選基因。根據試驗群體的蛋白質含量QTL-allele矩陣，預測出潛在雜交組合的純系后代的蛋白質含量育種潛力高達56.5%。檢測到90個大豆蛋白質含量QTL，新檢測到20個QTL，預測到73個蛋白質含量相關基因，表明大豆蛋白質含量是由多基因控制的數量性狀。

大豆；巢式關聯作圖群體；蛋白質含量；限制性兩階段多位點全基因組關聯分析

0 引言

【研究意義】大豆（(L.) Merr.）是世界上重要的經濟作物，是植物蛋白質和油脂的主要來源之一，提高大豆蛋白質含量是大豆重要的育種目標。解析大豆蛋白質含量的遺傳構成對大豆分子設計育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，大豆蛋白質含量是典型的數量遺傳性狀，由多基因控制，并且容易受環境條件的影響[1-2]。近年來，隨著基因組測序技術和遺傳統計方法的迅速發展，前人分別利用雙親本衍生分離群體和自然群體，對大豆蛋白質含量的遺傳構成進行了大量研究。根據大豆SoyBase數據庫及相關文獻，迄今為止，至少有248個大豆蛋白質含量QTL（quantitative trait loci）已被報道，分布在大豆的20條染色體上[2]?；谶B鎖定位方法，Karikari等[3]利用Linhefenqingdou×Meng8206衍生的重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體檢測到一個位于第7染色體上的多環境下穩定表達的大豆蛋白質含量QTL（），可以解釋13.59%—26.22%的表型變異；Zhang等[4]利用Huapidou（ZDD09982）×Qihuang26（ZDD23189）衍生RIL群體，在大豆第1、10和15染色體上檢測到3個表型變異解釋率14.00%以上的蛋白質含量QTL?；陉P聯分析方法，Li等[5]以185份來自國內外的大豆種質為材料，采用MLM（mixed linear model）方法，在第1、13和20染色體上檢測到3個遺傳貢獻率13.00%以上的穩定表達的QTL；Wang等[6]利用235份國內外收集的大豆品種，以FarmCPU（fixed and random model circulating probability unification）方法，檢測到12個多環境下穩定表達的與蛋白質含量顯著關聯的SNP。另一方面，以雙親本衍生分離群體為材料進行QTL定位，不能檢測雙親本間不具多態性的關鍵基因位點[7-8]；以自然群體為材料進行關聯分析，個體親緣關系導致的群體結構可能會導致關聯分析的假陽性[9]；相比之下巢式關聯作圖（nested association mapping，NAM）群體利用了多親本之間更多的遺傳差異，能夠相對較好地控制群體結構。因此，NAM群體結合了連鎖定位中QTL檢測高功效與關聯分析中高作圖精度的優點，成為解析復雜性狀解剖的很有發展前景的多親本遺傳設計[8,10]。在前期研究中，筆者構建了包含4個RIL群體的大豆NAM群體，并提出了全面解析NAM群體數量性狀遺傳構成的優化方法[11]。【本研究切入點】由于大豆蛋白質含量是典型的復雜數量遺傳性狀，人們對其遺傳構成還有待進一步深入了解。【擬解決的關鍵問題】本研究以大豆NAM群體為研究對象，利用RAD-seq進行基因分型并在5個環境下進行田間試驗，采用前期研究鑒定的適合于NAM群體的最佳QTL定位方法，來解析大豆NAM群體的蛋白質含量的遺傳結構以及推測相關候選基因，并從中探索構建該群體的5個親本的重組潛力，為高蛋白質含量的大豆品種育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以蒙8206（M8206）為共同親本，臨河×蒙8206（Linhe×M8206，LM，104 RILs）、正陽×蒙8206（Zhengyang×M8206，ZM，126 RILs）、蒙8206×通山（M8206×Tongshan，MT，289 RILs）、蒙8206×WSB（M8206×WSB，MW，104 RILs）分別得到F1代，通過單籽傳法自交7代獲得4個RIL群體，共計623個家系，整合為一個NAM群體。本研究NAM群體由南京農業大學國家大豆改良中心創制和保存。

1.2 田間試驗設計

NAM群體及親本分別于2012年、2013年和2014年在南京農業大學國家大豆改良中心江浦試驗站（江浦，簡稱JP2012、JP2013和JP2014），屬于北亞熱帶季風性濕潤氣候，雨量充沛、日照充足，無霜期230 d，年均氣溫15.3℃，降水量1 102.2 mm，年日照2 165.2 h；2012年在安徽科技學院鳳陽試驗田（鳳陽，簡稱FY2012），屬于北亞熱帶向溫帶漸變氣候，氣候溫和，光照充足，無霜期212 d，年均氣溫14.9℃，年降雨量904.4 mm，年日照2 248.7 h；2014年在江蘇沿海地區農業科學研究所（鹽城，簡稱YC2014），屬于亞熱帶與暖濕帶的過渡地帶氣候，氣溫適中，雨量充沛，無霜期213 d，年平均氣溫14.1℃，常年降水量1 042.2 mm，年日照2 238.9 h；共計5個環境進行田間試驗。每公頃施用三元復合肥（N-P2O5-K2O）225 kg，其中N 15%、P2O515%、K2O 15%，總養分含量≥45%。采用完全隨機區組設計，3次重復，單行區，行長1 m，行距0.5 m，株距10 cm，常規田間管理。

1.3 蛋白質含量測定及數據統計分析

大豆自然成熟（完熟期R8）時，每個小區植株收獲后脫粒，通風晾干并在35—40℃烘干至恒重，選取籽粒大小一致、飽滿的種子，采用FOSS公司生產的近紅外谷物分析儀InfratecTM 1241 NIR Grain Analyzer（Sweden）測定大豆種子蛋白質含量，樣品測定為近紅外透射技術，波長范圍570—1 100 nm，完全整粒無損分析，無需磨粉，儀器內置大豆模型，直接顯示蛋白質含量測定結果。分別對NAM群體在每個環境下的3次重復進行蛋白質含量檢測。

1.4 SNP基因型分析與SNPLDB標記構建

NAM群體的SNP基因型與SNPLDB標記來源于Li等[11]文獻。利用Restriction-site associated DNA sequencing（RAD-seq）技術對NAM群體進行SNP標記基因分型。由于一個SNP標記位點只有2種等位變異，又稱為雙等位變異標記，SNP不適合NAM群體中存在復等位變異的基本特征。因此，本研究把位于一個連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）區段內緊密連鎖的多個SNP，作為該基因組區域的一段序列，劃分為一個SNP連鎖不平衡區塊（SNP linkage disequilibrium block，SNPLDB），簡稱為SNPLDB標記。并且用NAM群體的親本單倍型作為其等位變異，增加每個標記位點的單倍型/等位變異的數量，來匹配NAM群體的復等位變異特征?；谝陨戏治觯琋AM群體共鑒定了55 936個SNP和6 137個SNPLDB標記。

1.5 全基因組關聯分析

采用賀建波等[12-13]提出的限制性兩階段多位點全基因組關聯分析方法（restricted two-stage multi-locus genome-wide association analysis，RTM-GWAS），基因型數據為NAM群體的6 137 SNPLDB標記，表型數據為5個環境下蛋白質含量的小區觀測值（含每個環境下的3次重復數據）。RTM-GWAS方法分兩階段進行：第一階段，基于簡單線性模型進行單位點關聯檢驗，對SNPLDB標記進行初步篩選，使用常規顯著水平0.05作為篩選閾值；第二階段，對第一階段篩選到的顯著位點，利用多位點模型分析進行QTL檢測，并估計等位變異效應，顯著水平設為0.01。在這兩個階段中，將基于SNPLDB標記的個體間遺傳相似系數矩陣的前10個特征向量作為協變量進行群體結構控制。

根據McCouch等[14]提出的QTL命名法，以“q”+性狀名稱+染色體編號+QTL序號，用斜體表示。如，表示QTL，表示大豆種子蛋白質含量，表示該QTL定位在第6染色體上，表示該染色體上第1個蛋白質含量QTL。

1.6 候選基因預測

根據檢測到的蛋白質含量QTL，推斷其候選基因體系。首先，利用大豆基因組數據庫SoyBase（http://soybase.org），檢索關聯SNPLDB標記（±100 kb）物理范圍內的注釋基因；然后在這些基因中，鑒定出NAM群體中該物理區間內SNP所在的基因；最后，使用卡平方（c2）獨立性測驗（test for independence），顯著性水平設置為0.05，檢驗SNPLDB標記（復等位變異）和注釋基因中SNP（雙等位變異）之間是否顯著相關。當這二者存在顯著相關時，則該SNP所在的注釋基因被認為是候選基因。大豆參考基因組Williams 82（Glyma.Wm82.a1.v1.1）[15]用于基因功能注釋。

2 結果

2.1 蛋白質含量表型數據分析

NAM群體的蛋白質含量變異較大，在5個環境下平均值的變異幅度為36.6%—46.0%，在5個單環境之間的變異幅度為31.5%—47.8%。NAM群體的共同親本（M8206）的蛋白質含量為36.3%，低于其他4個親本（臨河、正陽、通山和WSB），這4個親本的蛋白質含量分別為47.8%、44.7%、45.1%和42.9%。蛋白質含量廣義遺傳率較高，即遺傳變異可以解釋85.00%的蛋白質含量表型變異（表1）。多環境聯合方差分析結果表明，蛋白質含量在NAM群體中不同基因型之間存在顯著差異，同時環境、重復之間、基因型×環境互作也達到了差異極顯著水平（＜0.01），表示蛋白質含量受到外在環境條件影響較大，但是基因型間均方遠大于基因型×環境互作的均方（表2）。

表1 大豆NAM群體中蛋白質含量（%）的次數分布和描述性統計

a：試驗環境。平均值是5個環境FY2012、JP2012、JP2013、JP2014和YC2014蛋白質含量的平均值。b：變異系數

a: environment. Mean is the average over five environments FY2012, JP2012, JP2013, JP2014 and YC2014.b: Coefficient of variation

表2 大豆NAM群體中蛋白質含量的多環境聯合方差分析

2.2 全基因組關聯分析

利用RTM-GWAS方法解析NAM群體中蛋白質含量的遺傳構成，共檢測到90個蛋白質含量QTL，分布在大豆20條染色體上，每條染色體上具有1個（第9、12和17染色體）至12個（第6染色體）QTL，單個QTL的表型變異解釋率為0.06%—3.99%，共解釋45.6%表型變異（圖1和表3）。其中，、、、、、、、、和等10個蛋白質含量QTL的表型變異解釋率分別為3.99%、2.46%、2.42%、1.85%、1.74%、1.71%、1.64%、1.45%、1.30%和1.02%，貢獻均超過1.00%的表型變異，為大貢獻QTL（large-contribution QTL），共解釋19.60%的表型變異；其余80個小貢獻QTL（small-contribution QTL），共解釋26.00%的表型變異。

水平虛線為0.01顯著性水平，-lgP范圍介于2.0—89.2，大于10的值以8—11的值顯示

表3 大豆NAM群體中檢測到的蛋白質含量QTL

表型貢獻大于1.0%和小于1.0%的QTL，分別稱為大貢獻（LC）QTL和小貢獻（SC）QTL。2：每個QTL位點的遺傳貢獻率。a：Soybase報道的相對一致的蛋白質含量（seed protein content） QTL。67(119)表示本研究檢測到的67個QTL與Soybase中119個QTL相鄰近。b：GWAS QTL 指文獻報道的關聯分析QTL；33(45)表示本研究檢測到的33個QTL與以前報道的關聯分析文獻中的45個QTL相一致

Those with phenotypic contribution more than 1.0% and less than 1.0% are called roughly as large-contribution (LC) QTL and small-contribution (SC) QTL, respectively.2: genetic contribution of a QTL.a: SoyBase QTL means the loci are relatively consistent with the seed protein content QTL found in SoyBase; 67 (119) indicates that 67 QTLs detected in this study were located in or around 119 QTLs by linkage mapping in SoyBase.b: GWAS QTL means the QTLs detected in previous GWAS literature; 33 (45) indicates that 33 QTLs detected in this study were consistent with 45 QTLs reported in previous GWAS literature

根據多環境聯合方差分析，遺傳變異解釋的蛋白質含量表型變異，即性狀遺傳率為85.00%。本研究檢測到的90個蛋白質含量QTL表型變異貢獻率為45.60%，推測剩余的39.40%的遺傳變異的來源于未定位到的微效QTL，QTL×環境互作與試驗誤差解釋15.00%蛋白質含量表型變異。

2.3 蛋白質含量QTL-等位變異矩陣

NAM群體檢測到的90個蛋白質含量QTL中，每個QTL包含2—5個等位變異，共鑒定了303個等位變異效應，其中增效等位變異156個，減效等位變異147個，增效等位變異的效應值為0.007%—2.845%，減效等位變異的效應值為-0.012%—-2.434%，90.8%的等位變異效應值為-1.000%—1.000%，表明大多數等位變異的效應值較小，具有極高或極低表型效應的等位變異較為少見（圖2）。

NAM群體的623個家系中90個QTL的303個等位變異效應，組成了一個蛋白質含量QTL-等位變異矩陣（QTL-allele matrix），全面顯示了該群體蛋白質含量的遺傳構成信息。圖2為NAM群體的蛋白質含量QTL-allele矩陣圖，每個QTL的等位變異效應以顏色的深淺表示。從蛋白質含量QTL-allele矩陣圖中可以看到，不存在等位變異效應完全是減效或增效的NAM家系。蛋白質含量高低的差異在于不同家系中的減效或增效等位變異的構成比例，高蛋白質含量值家系比低值家系具有更多的增效等位變異。此外，高蛋白質含量家系存在一定數量的減效等位變異，而低蛋白質含量家系也存在某些增效等位變異，表明蛋白質含量改良存在很高的重組潛力，并且在育種利用中低蛋白質含量家系的優異變異不應被忽略。

2.4 NAM群體5個親本的蛋白質含量育種潛力

利用NAM群體的蛋白質含量QTL-allele矩陣來預測5個親本（臨河、正陽、通山、WSB和蒙8206）的蛋白質含量的育種潛力。表4為NAM群體的5個親本之間潛在的10個雜交組合的蛋白質含量預測結果。根據RTM-GWAS法檢測到的5個親本的蛋白質含量QTL-等位變異效應值，計算潛在雜交組合F2單籽傳衍生的10 000個純系后代蛋白質含量預測值。分別以5%分位數和95%分位數作為預測組合純合基因型后代的低值和高值。

橫軸表示以蛋白質含量（%）升序排列的種質材料，縱軸表示以增效等位變異頻率升序排列的QTL。每行表示一個QTL在不同材料中的等位基因分布，而每列表示一份材料在所有QTL上的等位基因構成。等位基因效應以顏色表示，等位變異效應以顏色表示，即具有暖色的格子代表增效等位變異，而具有冷色的格子代表減效等位變異，顏色的深淺代表等位變異效應的大小

表4 大豆NAM群體5個親本之間潛在雜交組合后代的蛋白質含量預測值

Table 4 The predicted protein content value of progenies derived from the possible crosses among the five parental lines in the soybean NAM population

Y1和Y2分別為2個親本的表型觀測值；P5和P95分別表示第5和第95個百分位數

Y1 and Y2 represent the observed phenotypic values of the two parents; P5 and P95 represent the 5th and 95th percentile

在連鎖模型預測下，構成大豆NAM群體的4個RIL群體對應的4個雜交組合，臨河×蒙8206、正陽×蒙8206、蒙8206×通山和蒙8206×WSB組合在5%—95%百分位數（預測5%范圍）的蛋白質含量預測值分別是37.8%—46.3%、37.1%—43.9%、37.5%—43.9%和36.4%—42.7%，而這4個RIL群體的實際表型觀測值范圍是38.4%—46.0%、36.7%—44.4%、36.7%—45.4%和37.1%—43.2%，表明如不打破連鎖，現實的變異潛力與預測的變異潛力相差不大。

如果在獨立模型下發生進一步遺傳重組，基因組將會發生更大的潛在分離重組。5個親本之間的10個潛在雜交組合后代的5%—95%百分位數范圍，在連鎖模型下預測值為36.4%—50.9%，在獨立模型下為33.1%—56.5%，比個別雜交組合變異更加廣泛。因此，RTM-GWAS構建的QTL等位基因矩陣，提供了一個親本材料基因分型與預測親本之間遺傳潛力的方法。

2.5 蛋白質含量相關候選基因體系

根據NAM群體中檢測的90個蛋白質含量QTL，推斷73個蛋白質含量相關候選基因，共解釋39.90%的表型變異。根據候選基因的功能注釋，這些候選基因歸為6類生物學過程，包括蛋白質代謝、DNA代謝、信號轉導、代謝過程、胚發育和未知過程等（圖3）。

第Ⅰ組，具有27個氨基酸和蛋白質代謝相關候選基因，解釋18.70%表型變異，包括參與甘氨酸與芳香族氨基酸代謝（）、半胱氨酸生物合成（）、氨基酸生物合成和分解代謝（、、和）、蛋白磷酸化（、、等）、依賴泛素的蛋白質分解代謝（、）、蛋白水解（、、）的基因。

第Ⅱ組，具有17個DNA代謝相關候選基因，解釋8.80%表型變異，包括參與依賴DNA的轉錄調控（、、等）、DNA甲基化（）的基因。

第Ⅲ組，具有13個信號轉導與運輸過程相關候選基因，解釋6.80%表型變異，包括參與生長素和油菜素內酯刺激的響應（）、信號轉導（和）、氨基酸運輸（）、高爾基體囊泡介導的運輸（和）、跨膜運輸（）的基因。

第Ⅳ組，具有5個代謝過程相關候選基因，解釋1.70%表型變異，包括參與碳水化合物代謝（）的基因。

Ⅰ—Ⅵ：蛋白質含量候選基因的6類生物學過程

第Ⅴ組，具有2個胚發育相關候選基因，解釋1.10%表型變異，包括參與減數分裂（）、種子休眠之前胚發育（）的基因。

第Ⅵ組，具有9個蛋白質含量性狀間接相關的未知過程候選基因，解釋2.80%表型變異，包括、、等基因。

3 討論

3.1 大豆蛋白質含量表現數量遺傳特點

大豆蛋白質含量屬于復雜數量遺傳性狀，由若干遺傳效應大小不一的基因控制，并且受到環境條件的影響[1,5]。本研究NAM群體蛋白質含量的變異幅度為36.6%—46.0%，表現近似正態連續分布的數量遺傳特點。根據前人數量性狀單基因與多基因遺傳模型，蓋鈞鎰等[31]提出了植物數量性狀的泛主基因＋多基因混合遺傳模型，數量性狀可能由多個基因控制，遺傳效應大小不等且容易受環境影響；在一般試驗條件下可以檢測到、效應較大的基因作為主效基因，而在現有試驗條件下不能單獨檢測到、效應相對非常小的基因作為微效基因或多基因；主效與微效基因之間的區別是相對的，取決于試驗誤差或精度，在一種環境中某一基因可能作為主效基因，而在另一環境中受誤差干擾表現為微效基因。因此，數量性狀由主基因與多基因共同控制是數量性狀遺傳的基本模型，而純主基因或純多基因的遺傳模型只是其個別特例。Zhang等[20]利用多位點復等位變異關聯分析方法RTM- GWAS來解析中國大豆地方品種群體蛋白質含量的QTL-allele體系，檢測到89個蛋白質含量QTL，遺傳貢獻率為0.04%—11.30%，本研究利用相同方法來解析大豆NAM群體的蛋白質含量的遺傳構成，檢測到90個蛋白質含量QTL，遺傳貢獻從0.06%—3.99%，該結果很好地驗證了蓋鈞鎰等[31]提出的泛主基因＋多基因數量性狀混合遺傳模型假說，更進一步表明大豆蛋白質含量是一個典型的數量遺傳性狀。

3.2 本研究檢測到蛋白質含量QTL與文獻報道QTL比較

大豆蛋白質含量是許多微效基因控制的復雜數量性狀，同時也受環境條件的影響[2,5]?；陔p親分離群體的連鎖定位和自然群體的關聯分析方法，以前的研究已經報道了許多大豆蛋白質含量QTL。目前在大豆基因組數據庫SoyBase中公布了248個基于連鎖定位的蛋白質含量QTL，其中一些QTL在不同群體中在相同或非常相近的染色體位置被檢測到了3次或更多次，表明這些QTL是非?？尚诺?，然而這些已知的QTL在應用到標記輔助育種工作之前需要進一步驗證。因此，本研究根據相關標記的參考基因組的物理區域（Glyma.Wm82.a1.v1.1）對本研究檢測到的蛋白質含量QTL與前人報道的QTL進行比較。

本研究檢測到了90個蛋白質含量QTL，分布在所有20條染色體上，其中67個QTL位于或接近SoyBase中已經報道的119個QTL區間，33個QTL與以前報道的關聯分析文獻中的45個QTL相一致，其余20個QTL是本研究中新檢測到的。在NAM群體中檢測到的90個蛋白質含量QTL中，具有最大的遺傳貢獻率3.99%，前人通過連鎖定位方法檢測到的4個蛋白質含量QTL位于該QTL區域附近，包括Seed protein 30-5[32]，cqSeed protein-005、cqSeed protein-007和cqSeed protein-015[33]；前人通過關聯分析方法檢測到的2個QTL與該QTL相一致，包括Gm06_5660542[16]與Gm06_6067567[17]。并且，還有6個大貢獻QTL同時與前人連鎖定位與關聯分析研究發現的多個QTL相一致，如（貢獻率2.46%）與Seed protein 33-5[34]和Gm07_7058915[18]的定位區域相臨近；（貢獻率1.85%）與Seed protein 2-2[35]、Seed protein 36-31[36]和Gm19_46335384[19]的定位區域相鄰近；（貢獻率1.74%）與Seed protein 34-2[37]和Gm06_12914255[20]的定位區域相鄰近；（貢獻率1.71%）與Seed protein 21-4[38]和Gm02_7987834[20]的定位區域相鄰近；（貢獻率1.45%）與Seed protein 26-12[39]、Seed protein 28-5[40]、Seed protein 36-25[36]和Gm18_2064407[21]的定位區域相鄰近；（貢獻率1.02%）與Seed protein 1-6[41]、Seed protein 4-10[42]、Seed protein 45-1[43]和Gm14_7160557[21]的定位區域相鄰近。在本研究新檢測的20個QTL中，（2.42%）和（1.30%）是大豆蛋白質含量的大貢獻QTL。

3.3 NAM群體5個親本的超親分離潛力

本研究預測了NAM群體5個親本（臨河、正陽、通山、WSB和蒙8206）之間潛在的10個雜交組合的純系后代的蛋白質含量，其預測值為33.1%—56.5%，表現出明顯的雙向超親分離潛力。Zhang等[20]預測了中國大豆地方品種群體潛在雜交組合的純系后代的蛋白質含量的育種潛力，其分離范圍是39.86%—55.71%。預測優異雜交組合是分子設計育種的前提，但是需要作物育種實踐來證明。Zhang等[44]報道了利用QTL-allele設計親本組配以及后代選擇創造大豆高蛋白質含量材料，從2個RIL群體中選擇了具有超親蛋白質含量表型的2個家系XG30（45.53%）和WT133（48.39%），并對3個已定位到的大效應加性QTL進行標記分型，WT133×XG30雜交后代表現出較大的超親分離，選育出蛋白質含量高達54.15%的品系材料，由此證明了QTL-allele矩陣在數量性狀的超親分離中的應用價值。此外，NAM群體蛋白質含量的QTL-allele中，蛋白質含量等位變異效應值從-2.434%—2.845%不等，但是絕大多數等位變異效應比較集中在-1.000%—1.000%，具有極高或低表型效應的等位變異較為少見，具有極端值的稀有等位變異對于選育高蛋白質大豆材料存在積極意義。

4 結論

共檢測到90個蛋白質含量QTL，其中新檢測到20個QTL，貢獻率總和為45.60%，預測了73個蛋白質含量相關基因。根據NAM群體的蛋白質含量QTL-allele矩陣，預測出潛在雜交組合的純系后代的蛋白質含量為33.1%—56.5%。

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Genetic dissection of protein content in a nested association mapping population of soybean

LI ShuGuang1,2, CAO YongCe1, HE JianBo1, WANG WuBin1, XING GuangNan1, YANG JiaYin2, ZHAO TuanJie1, GAI JunYi1

(1Soybean Research Institute, Nanjing Agricultural University/National Center for Soybean Improvement/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministry of Agriculture/State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210095;2Huaiyin Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai Region in Jiangsu, Huai’an 223001, Jiangsu)

【】Soybean is an important cash crop, a major source of plant protein and oil for human diet. As a major objective of soybean breeding, protein content is a complex trait controlled by multiple genes with varying genetic effects interacting with environment. A genome-wide association study (GWAS) was conducted to dissect the genetic architecture of protein content in a soybean nested association mapping (NAM) population, and the detected genetic constitution can be further used for molecular design in soybean breeding for high protein content. 【】Four soybean recombinant inbred line (RIL) populations (Linhe×M8206, Zhengyang×M8206, M8206×Tongshan and M8206×WSB) with a common parent (M8206) as a NAM population were constructed, genotyped with RAD-seq (restriction-site-associated DNA sequencing) and tested under multiple locations in 2012 - 2014. Protein content was measured at full maturity (R8) stage. The restricted two-stage multi-locus GWAS (RTM-GWAS) procedure was used to dissect the genetic architecture of seed protein content of the population. 【】The protein content varied widely in the population with trait heritability estimated as high as 85.00%. The analysis of variance for protein content showed significant differences across genotypes, environments and genotype-by-environment interactions. A total of 90 QTLs were detected to be associated with protein content, with 20 loci being novel ones. The phenotypic variation explained by each QTL ranged from 0.06% to 3.99%, with a sum of 45.60%. The number of alleles at each locus ranged from 2 to 5, and the allele effects ranged from -2.434% to 2.845%, while most of them were between -1.000% and 1.000%. From the detected QTLs, 73 candidate genes were annotated. Among these candidate genes,involved in cysteine biosynthetic process, andinvolved in glycine and aromatic amino acid family metabolic process. The two genes may be selected for further functional study. Based on the QTL-allele matrix of protein content, the predicted transgressive potential of cross progeny was as high as 56.5%. 【】A total of 90 QTLs for protein content were detected with 20 loci being novel, from which 73 candidate genes were annotated, indicating that protein content is a complex trait conferred by multiple genes or a gene network.

soybean [(L.) Merr.]; nested association mapping population (NAM); protein content; restricted two-stage multi-locus genome-wide association analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.005

2019-08-26；

2019-11-30

國家自然科學基金（31701447，31571695）、國家作物育種重點研發計劃（2017YFD0101500，2017YFD0102002）、長江學者和創新團隊發展計劃（PCSIRT_17R55）、教育部111項目（B08025）、中央高?；究蒲袠I務費項目（KYT201801）、農業部國家大豆產業技術體系CARS-04、江蘇省優勢學科建設工程專項、江蘇省JCIC-MCP項目、淮安市科技計劃（HAB201846）、淮安市農業科學研究院院長科研基金（HNY201703）、作物遺傳與種質創新國家重點實驗室開放課題基金（ZW201713）、江蘇省自然科學基金（BK20151285）

李曙光，E-mail：dawn0524@126.com。通信作者賀建波，E-mail：hjbxyz@gmail.com。通信作者蓋鈞鎰，E-mail：sri@njau.edu.cn

（責任編輯 李莉）