柑橘CCD基因家族鑒定及CcCCD4a對果肉顏色的影響

張亞飛，彭潔，朱延松，楊勝男，王旭，趙婉彤, 2，江東, 2

柑橘CCD基因家族鑒定及對果肉顏色的影響

張亞飛1，彭潔1，朱延松1，楊勝男1，王旭1，趙婉彤1, 2，江東1, 2

（1西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2中國農業科學院柑桔研究所，重慶 400712）

【】研究類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD）基因家族在柑橘基因組中的分布、結構及進化，對在果肉顏色形成過程中的表達及其在不同果肉顏色的柑橘種質中的基因型進行研究，為開發用于果肉顏色的分子輔助育種標記奠定基礎。根據已報道的CCD，采用同源比對法檢索柑橘基因組中的CCD家族基因（）。采用生物信息學軟件構建系統進化樹，進行亞細胞定位預測，預測蛋白質的相對分子質量與等電點（pI）等理化性質，預測保守motif，繪制家族基因Scaffold定位圖。利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）分析在柑橘果實顏色發育過程中的表達模式，利用測序技術鑒定30個柑橘品種的基因型，采用Tassel軟件進行單倍型分析。從克里曼丁橘（）基因組中鑒定出14個CcCCD基因家族成員，可將其分為5個亞家族，即CcCCD1、CcCCD4、CcCCD7、CcCCD8和CcNCED。該家族蛋白理論等電點分布在6.05—8.53，編碼氨基酸數目介于412—611個；亞細胞定位預測結果顯示該基因家族成員主要位于葉綠體和細胞質中；聚類分析發現，CCD8亞家族與其他家族成員遺傳距離較遠，柑橘中各均能在其他物種中找到同源基因；Scaffold定位分析發現，14個CCD家族成員成員分布在除5號Scafflod外的所有Scafflod上，且分布不均勻。對10個柑橘品種在4個時期的果肉色澤進行表型鑒定，隨著果實趨于成熟，果肉的色調角（h）逐步下降，果肉顏色逐步加深；在不同柑橘品種中相對表達量存在顯著差異，果肉顏色為濃橙紅色的品種表達量顯著低于果肉為橙色或淺橙黃色的品種(＜0.05)，相對表達量與色調角呈顯著正相關(＜0.05)；對30個柑橘品種進行測序分析，發現單倍型hap-1、hap-4和hap-5為果肉濃橙紅色品種優勢單倍型。‘克里曼丁’橘包含14個CCD基因家族成員，各成員均含有RPE65保守結構域，并定位于細胞的不同位置，分布在不同的Scaffold上。參與柑橘果肉顏色的形成，其基因相對表達量與果肉色調角呈顯著正相關，可作為潛在的柑橘果實顏色的輔助育種標記，尤其是單倍型hap-1、hap-4、hap-5與果肉紅色的關聯度較高，對顏色育種的早期雜種群體篩選有一定幫助。

柑橘；CcCCD基因家族；；果肉顏色；基因表達；單倍型

0 引言

【研究意義】柑橘是世界范圍內最重要的經濟作物之一，其艷麗的果肉、果皮色澤是吸引消費者的重要因素之一，也是育種學家所關注的重要性狀。已有研究表明，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD）基因廣泛參與果實顏色的調控[1]。利用生物信息學的方法對柑橘全基因組的CCD基因家族（CcCCD）進行全面分析，重點對在柑橘果肉顏色發育過程中的基因表達和不同果肉顏色柑橘種質中的基因型進行研究，對指導培育果肉為橙紅色的柑橘品種具有重要意義。【前人研究進展】類胡蘿卜素是一類在動植物中廣泛存在的類異戊二烯色素。葉黃素（Xanthophylls）、紫黃質（Violaxanthin）是植物捕光蛋白復合物的關鍵組成部分[2]，番茄紅素（Lycopene）、-胡蘿卜素（-carotene）等是影響植物花和果實顏色的重要色素[3-4]，其含量高低決定了果肉色澤的深淺。高等植物中主要由類胡蘿卜素裂解雙加氧酶負責類胡蘿卜素的氧化裂解，CCD是一類非血紅素鐵酶，均含有RPE65（Retinal pigment epithelial membrane protein）結構域，負責結合Fe2+[5]。根據其底物是否含有環氧結構，可將其進一步劃分為類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCDs）和9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCEDs）[6-7]。在擬南芥中共鑒定到9個CCD成員，其中4個CCDs成員（），5個NCEDs成員（）。在9'-10'雙鍵裂解C40類胡蘿卜素，形成C13、C14小分子揮發性物質，對植物香氣的形成具有重要影響[8-10]。和主要參與植物激素調節，其裂解產物是植物激素獨角金內酯的重要前體[11-12]。以環氧類胡蘿卜素為底物，是植物脫落酸（ABA）合成的限速酶，對植物抗逆性有重要作用[13-14]。成員較為復雜，在擬南芥、水稻、薔薇等都只鑒定到了一個成員[1,7,15]，而在番茄、葡萄、藏紅花、菊花[16-19]等鑒定到了多個，目前證據表明其可能參與花、果皮、果肉顏色的形成，柑橘的底物為-隱黃質和玉米黃質，裂解位點在7'-8'雙鍵，代謝產物為柑橘所特有的C30類胡蘿卜素，使橘皮表現為橙紅色[20-21]。ZHENG等[22]研究發現啟動子上的一個MITE插入導致表達增強積累更多橙紅色的C30類胡蘿卜素。日本學者Minamikawa等[23]利用柑橘資源及雜種群體的全基因組關聯分析，發現與果肉顏色性狀強關聯的1個SNP位于附近，暗示可能直接或間接影響柑橘果肉顏色的形成。CCD由于具有多種生物學功能，在調節植物的生長發育、非生物脅迫和顏色形成等方面具有重要作用，因此倍受研究者的關注。【本研究切入點】CCD基因家族廣泛參與植物生長發育和果實顏色形成，但目前對CCD基因家族的研究主要集中在擬南芥、番茄、水稻等模式植物中，對柑橘CCD基因家族進行全基因組鑒定尚未見報道。可能參與調控柑橘果肉顏色的形成，但該基因在果實顏色形成過程中的表達與果肉顏色變化之間的關系尚不清楚，不同顏色柑橘品種的基因型也未有研究。【擬解決的關鍵問題】本研究對CcCCD基因家族成員進行鑒定，并對該家族的基本信息、Scafflod定位、系統進化等進行預測分析；同時，選擇10個柑橘品種，利用qRT-PCR技術測定果肉色澤形成期在不同柑橘品種中的表達特征，同時通過對30個柑橘品種的基因型鑒定，為探究功能和開發基于的分子標記奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 柑橘CCD基因家族成員鑒定

柑橘‘克里曼丁’橘（）基因組和蛋白組[24]數據下載自NCBI（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）。通過如下4種方法鑒定CcCCD家族成員：（1）下載RODRIGO等鑒定的5個[21]（、、、、）；（2）用柑橘中已鑒定到的5個和其他物種中已知的CCD家族基因（附表1）蛋白序列在克里曼丁橘蛋白質組數據庫進行Blast搜索，獲取柑橘中的同源序列；（3）在Pfam數據庫（http://pfam.xfam.org/）中下載所有物種RPE65（PF03055）結構域序列，利用Hmmer2.3（http://hmmer.janelia.org/）構建隱馬氏模型，在克里曼丁橘蛋白數據庫中搜索含有RPE65結構域的序列；（4）合并（1）（2）（3）的結果，將得到的結果使用在線工具SMART（http://smart.embl- heidelberg.de/）分析結構域，去除不包含RPE65結構域的序列，最終得到CcCCD家族所有基因。

1.2 CcCCD家族生物信息學分析

對CcCCD蛋白的分子量和等電點使用ExPASy Proteomics Server（http://www.expasy.org/proteomics）進行預測。用在線軟件MBC（http://cello.life.nctu.edu. tw）對CcCCD蛋白進行亞細胞定位預測。利用MEGA7（https://www.megasoftware.net/）中的MUSCL程序將鑒定到的CcCCD家族蛋白序列和其他物種的CCD家族蛋白進行多重序列比對，并利用近鄰法（Neighbor- Joining，NJ）構建系統進化樹（bootstrap=1 000）。柑橘中已有命名的名稱不變，未命名的基因根據擬南芥中同源基因命名，沒有同源基因的命名為，同一個亞家族內的基因根據染色體上的位置按照小寫字母依次排序。用在線工具MEME（http://meme-suite.org/）鑒定各家族成員motif。在phytozome數據庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/）中下載CcCCD成員的注釋信息，用GSDS （http://gsds. cbi.pku.edu.cn/）制作基因結構圖。同時獲取基因的位置信息，用在線工具MG2C（http://mg2c.iask.in/ mg2c_v1.1/）展示Scafflod定位圖。

1.3 試驗材料

本試驗用于基因分型的30份柑橘種質資源均來源于國家果樹種質重慶柑橘資源圃（具體信息見表1），除猴橙為甜橙外，大部分材料為寬皮柑橘及其雜種。2019年4月選取樹勢中等、樹體健康的植株隨機采集春梢葉片，液氮研磨后用于DNA提取。選取10株果肉色澤具有明顯差異的柑橘植株，取果實進行基因表達分析（表1中編號1—10的材料），從果實轉色期開始，每15 d采樣一次（2019年9月28日、10月12日、10月27日、11月13日），直到充分轉化為該品種固有色澤，拍照，進行色澤表型鑒定，取果肉液氮研磨用于RNA提取。

1.4 果肉色澤測定

取不同時期樣品果實沿赤道面橫切，使用CR-400色差計（柯尼卡美能達）記錄各樣品顏色信息。采用Lab模型描述所測得的顏色數據。根據測量得到的*、*值按照公式h=tan-1（b*/a*）獲得色調角h，色調角h取值在0°—90°代表色澤介于紅色與黃色，數值越小越偏向于紅色，反之越偏向于黃色。本試驗測定條件為：光源D65，標準觀察角度2°，照明區域Φ50 mm。每個樣品進行3次生物學試驗重復，每次重復進行5次數據測定。

1.5 實時熒光定量PCR

使用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒（DP432，天根）提取植物總RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit With gDNA Eraser Perfect Real Time（RR047，TaKaKa）試劑盒將RNA反轉錄成cDNA 供熒光定量使用。使用Prime3（https://primer3plus. com）設計引物，引物信息見表2。內參基因為柑橘，在CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀上對在10個柑橘品種中不同時期的表達量進行分析。擴增體系含2 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL（10 μmol?L-1），SYBR 6.25 μL，ddH2O 3.25 μL，總體系12.5 μL。反應程序為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，95℃延伸15 s，40個循環，每個處理3次重復。以2ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 本研究30份柑橘材料

1.6 基因型分析

取30份研磨后的葉片樣品用CTAB小量法提取基因組DNA。根據NCBI上公布的克里曼丁橘基因組，使用Prime3設計引物，引物序列見表2。使用DNA小量回收試劑盒（Magen D2111-03）純化PCR產物。1—10號純化樣品委托深圳華大基因有限公司進行Sanger測序，每個樣品重復3次，使用DNAsp（http://www.ub.edu/dnasp/）軟件分析核苷酸多態性。另外，所有純化后的PCR產物稀釋到10 ng?μL-1，放入核酸超聲打斷儀（寧波新芝）中進行打斷處理（10 s超聲，5 s間歇；35個循環），使用二代測序建庫試劑盒（天津諾禾），構建插入片段為300 bp左右的illumina二代雙端測序文庫，經稀釋、變性后使用Illumina MiniSeq平臺測定30個柑橘品種序列。測序結果經BWA（http://bio-bwa.sourceforge. net/）比對到‘克里曼丁’橘基因組，經Samtools（http:// www.htslib.org/）轉換為bam文件后，再用Bcftools（http://www.htslib.org/doc/1.0/bcftools.html）檢測核苷酸變異生成vcf（Variant call format）文件，vcf文件經Tassel軟件（https://www.maizegenetics.net/tassel）分析編碼區單倍型。

1.7 數據處理

利用SPSS18軟件進行不同品種間基因表達差異的顯著性分析，不同品種間色調角h差異顯著性分析和色調角h與基因相對表達量的相關性分析。＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 CcCCD基因家族成員信息

通過Blast比對及Hmmer搜索，SMART分析去除不含REP65結構域的序列，從柑橘基因組中共鑒定出14個CCD基因，如表3所示。通過ExPASy工具分析，柑橘中最長的CCD蛋白（CcCCD_like）包含611個氨基酸，分子量為69.18 kD，是14個蛋白質中分子量最大的。最短的CCD蛋白（CcCCD4d）包含412個氨基酸，分子量是14個蛋白中最小的。等電點范圍為6.05（CcCCD1b）—8.53（CcCCD4c）。利用MBC軟件對CcCCD家族成員進行亞細胞定位分析，結果顯示該基因家族成員位于細胞不同位置，其中定位于細胞質，其他成員定位于葉綠體。

2.2 CCD基因家族系統進化分析

為研究CCD基因家族的遺傳進化關系，對已鑒定到的CCD家族基因進行系統進化分析，選取柑橘（）（14個），擬南芥（）（9個），水稻（）（9個），番茄（）（6個），葡萄（）（7個），菊花（）、獼猴桃（）、藏紅花（）（各3個），歐洲越橘（）、枸杞（）、蘋果（）、突厥薔薇（）（各1個）共56個CCD蛋白（具體信息見附表1）構建系統進化樹（圖1）。根據親緣關系可將56個CCD蛋白分為6個亞家族，分別為CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、NCED、CCD_like。CCD8亞家族與其他CCD亞家族的遺傳距離較遠，CCD1、CCD4和NCED亞家族具有更近的遺傳距離。

表2 引物信息

圖1 CCD家族蛋白系統進化樹

由于CcCCD_like序列不完整，系統進化分析不能很好的確定其所歸屬的亞家族，因此分析了CcCCD家族成員的motif。在CcCCD家族蛋白中使用MEME工具找到了10個motif，如圖2所示。CcCCD_like含有5個motif（4、5、6、7、10），CcCCD8亞家族含有6個motif（3、4、5、6、7、10），與CcCCD8亞家族相比，CcCCD_like只缺少第3個motif。

2.3 CcCCD家族基因結構及染色體定位分析

利用GSDS軟件對CcCCD家族各成員的基因結構進行分析（圖3）。結果顯示，CcCCD家族的基因結構存在較大的差異，外顯子數目為1—13個，內含子數目為0—12個。對基因結構進一步分析發現，CcCCD4和CcNCED亞家族的基因結構較簡單，除含2個內含子外，其他基因均不含內含子；CcCCD7和CcCCD8成員中多數基因含有3—6個內含子；而CcCCD1成員的基因結構較為復雜，內含子數目較多，、含有12個內含子，含有13個內含子。根據CcCCD家族在Scafflod的位置信息，利用MG2C工具獲得了14個在柑橘Scafflod上的分布圖（圖4）。由圖可知，CcCCD家族成員在Scafflod上分布不均。1號、4號、6號、8號Scafflod上分布較多，2號、3號、7號、9號Scafflod上，只含有1個CcCCD家族成員，而5號Scafflod上不含CcCCD家族成員。進一步分析發現，CcCCD在Scafflod上呈現區域性分布。

圖2 柑橘CCD蛋白motif分析

圖3 柑橘CCD家族基因結構

2.4 果肉顏色表型分析

本試驗將*、*兩值換算為h值來表示果肉顏色。10個柑橘品種在4個時期中h值介于77.28°（11月13日，紅橘）—100.80°（10月27日，春香），色澤介于橙紅色與淺橙黃色（圖5、圖6），多數品種隨著果實的成熟，h值不斷下降，在10月27日至11月13日期間下降最明顯。4個時期中橙色與淺橙黃色品種h值顯著高于橙紅色品種（圖6）。橙紅色品種中紅橘色澤更深，在11月13日，其h值顯著低于其他橙紅色品種，‘麗紅’在4個時期中h值下降緩慢，果肉色澤變化較小。橙色品種中‘青橘’的果肉色澤更為濃厚，其h值在最后一個時期也表現為顯著低于其他橙色品種，‘春見’與‘猴橙’的h值在4個時期中始終保持較高水平，各時期果肉色澤差異不顯著。淺橙黃色的‘春香’h值始終顯著高于其他品種，在4個時期中差異不明顯。

圖4 柑橘CCD基因在 Scafflod 上的相對位置

圖5 10個柑橘品種在4個時期的果肉色澤

不同小寫字母表示在P＜0.05水平差異顯著。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

2.5 果實發育過程中CcCCD4a表達情況

在4個時期檢測10個柑橘品種中的表達水平，結果如圖7。在10個柑橘品種間的相對表達量差異較大，與9月27日‘紅橘’相比，11月13日表達量最高的‘春香’達到52.40，而最低表達的‘麗紅’僅為0.04。4個時期橙紅色品種中‘茂谷柑’的表達量顯著高于其他橙紅色品種。橙色品種中‘猴橙’在第一個時期基因表達量顯著低于其他橙色品種，而在后3個時期中顯著高于其他橙色品種。淺橙黃色品種‘春香’始終保持較高水平表達，表達量顯著高于其他品種。

10個品種除‘茂谷柑’外，均表現出在果肉偏紅色的品種中趨于中低表達水平，在果肉偏黃色的品種中趨于高表達水平，推測該基因表達水平高低與果肉顏色具有相關性。以色調角h和相對表達量為隨機變量進行相關分析，結果顯示，隨著時間的延長，表達量與色調角h的相關性逐步增強，在最后一個時期相關系數為0.532（＜0.01），去除‘茂谷柑’后，相關系數為0.765（＜0.01），呈極顯著相關。

圖7 CcCCD4a在10個柑橘品種4個時期的相對表達量

2.6 CcCCD4a核苷酸多態性與單倍型分析

除‘茂谷柑’外，其余品種均符合高表達果肉偏黃色，低表達偏紅色的規律，為檢測‘茂谷柑’在基因結構上與其他品種的差異，對所選10份材料進行Sanger測序分析其核苷酸多態性。在10個柑橘品種的編碼區共鑒定到31個SNP位點（圖8），其中同義突變17個，非同義突變14個，共有8個氨基酸突變位于RPE65結構域。‘茂谷柑’與‘克里曼丁’相比，所含有的SNP位點最多為21個，而‘椪柑’‘沃柑’最少。

‘茂谷柑’共有4個特有SNP位點，分別位于第294、913、1 137和1 657 bp。294和1 137 bp處為同義突變，其余兩個為非同義突變且位于RPE65結構域上。913 bp變異導致第305位氨基酸由疏水性的丙氨酸突變為親水性的蘇氨酸，第1 657 bp處SNP導致第553位氨基酸由纈氨酸突變為異亮氨酸。

對10份柑橘材料的Sanger測序分析發現橙紅色果肉的‘紅橘’‘美國糖橘’具有完全相同的核苷酸序列（圖8），推測該基因的單倍型可作為柑橘果肉顏色的檢測標記。因此，重新采集20份果肉偏紅色的材料（表1）與原來的10份材料一起構建二代測序文庫，測定序列，用Tassel軟件進行單倍型分析，分析結果見表4。30個柑橘品種的具有9種單倍型，其中包含hap-1的12個品種均為寬皮柑橘中典型的橘類品種，且果肉均為橙紅色的品種，在這些品種中，個別還包含有hap-4、hap-5單倍型，其中以‘牛肉紅橘’和‘美國糖橘’的果肉顏色為最深，這兩份材料在162 bp處均為M，在669 bp處均為Y，而在669 bp處為Y的品種均表現為果皮紅艷。包含有hap-2單倍型的品種為‘溫州蜜柑’或是含有‘溫州蜜柑’血緣的雜柑品種，果肉也多為橙色至橙紅色。包含有hap-6單倍型的品種為典型雜柑類品種，果肉顏色通常為橙色至橙紅色，hap-7和hap-8為橙色至淺橙黃色品種，具有甜橙類基因的滲入，hap-9只包含‘茂谷柑’，該品種也是天然的橘橙雜種，明顯具有‘甜橙’基因的滲入。

3 討論

CCD基因家族是一類具有RPE65結構域的基因家族，其所編碼蛋白參與類胡蘿卜素代謝途徑，通過裂解C40類胡蘿卜素產生衍生代謝產物。從酵母到人類，幾乎所有真核生物都含有CCD，尤其是植物存在大量該類基因，如擬南芥基因組中存在9個[6]，水稻中鑒定出11個[1]，番茄中鑒定出9個[16]，葡萄中鑒定到19個[17]。本研究從‘克里曼丁’基因組數據庫中獲得了14個CCD基因家族成員，與其他物種成員數不同，表明不同物種的CCD成員數存在差異，而這一差異主要表現在CCD4亞家族上，在擬南芥、水稻、馬鈴薯等顏色相對單一的植物中，一般只有1個，而在番茄、葡萄、藏紅花、柑橘等顏色豐富且差異較大的植物中數目較多，這表明該基因在進化過程中可能存在基因擴增事件而通過選擇得以保留。CcCCD基因家族的蛋白相對分子質量大小在45.86—69.18 kD，但大多數為65 kD左右，pI在5.98—8.53，表明CcCCD家族成員之間的蛋白質大小、pI等特征參數差異不大，這一結果與其他物種相似。motif分析顯示與CcCCD8亞家族更為相似，推測屬于CcCCD8亞家族。

本研究利用柑橘中的CCD家族成員與其他作物中報道的CCD家族成員進行系統演化分析，由于CCD基因的保守性，具有相似或者相同功能的基因常位于同一組，這為研究該基因家族相關基因的功能提供了重要依據。擬南芥中，與聯合將-胡蘿卜素轉變為獨角金內酯的前體己內酯，繼而使植物生長發育[25]，藏紅花中、的表達通過影響獨角金內酯的合成進而影響頂芽的分化[18]，類似的在獼猴桃[26]、番茄[27]、水稻[28]等植物中，與參與了調控衰老、根的生長、分枝分蘗和花的發育等多種生命活動，由此推測柑橘CcCCD7、CcCCD8亞家族可能具有相同或相似的功能。NCED亞家族成員是ABA生物合成的限速酶，通過調節ABA的代謝，進而影響植物生命過程[29-30]。Kato等[31]曾在2006年通過Race擴增出柑橘與，通過重組蛋白表達發現與能在11'-12'位雙鍵裂解紫黃質生成黃質醛（Xanthoxin），這與擬南芥相似，而本研究鑒定到的6與為同源基因，由此推測與具有相似的功能。

對類胡蘿卜素的裂解與果肉、花器官的著色有關。過表達擬南芥的水稻中-胡蘿卜素和葉黃素分別降低74%和72%，-紫羅酮增加了2倍[32]。功能的缺失也會造成果實、花器官顏色的改變，比如杜鵑花瓣由黃色褪為白色[33]，洋橘梗淺黃色和白色花的形成[34]，以及百合花由黃變白[35]等表型的改變和形成均由裂解類胡蘿卜素功能改變所造成。不同于其他物種的在9'-10'雙鍵裂解類胡蘿卜素，柑橘中較為特殊，其裂解位置為7'-8'雙鍵，產物為柑橘所特有的C30類胡蘿卜素（-citraurin，-citraurinene等），其高表達誘導柑橘果皮變紅[22]。由于在果實發育過程中表達量極低，在柑橘EST數據庫（http://harvest.ucr.edu/）中缺乏EST序列，因此被認為是假基因[21]；、多在花瓣中表達，在果皮、果肉中均未檢測到[21]，而前期的研究發現柑橘果肉顏色性狀與附近的SNP位點存在顯著的相關性[23]，基于此研究結果，選擇作為本研究的重點。

本研究結果表明，隨著果實的成熟，果肉顏色逐步由淺色調向深色調過渡，h值逐漸降低，顏色逐步加深，涉及的10個品種在11月13日果肉顏色差異最為明顯，其后盡管顏色還會趨于加深，但果肉色澤與11月13日相比均沒有顯著差異，因此，以11月13日作為采樣最終時間。本試驗測定了10個柑橘品種在4個時期的相對表達量和色調角h，發現在不同品種中的表達量與色調角h顯著正相關，說明在一定范圍內，高表達使果肉顏色偏向于更淡，低表達使果肉顏色偏向于更紅。這一結果與ZHENG等[22]關于的研究相反，該作者認為使果皮表現為紅色的色素主要是高含量的C30類胡蘿卜素，如-檸烏素（-citraurin）和-香茅素（-citronella）等，而MA[36]和AGóCS[37]等認為果肉表現的橙紅色多由C40類胡蘿卜素含量決定，如在橙紅色的‘溫州蜜柑’和‘麗紅’果肉中含有大量的-隱黃質等C40類胡蘿卜素。在其他物種中，同源基因功能的研究與本試驗更為相似，比如葡萄中的底物為紅色的番茄紅素，產物為淺橙色的6-甲基-5-庚烯-2-酮[17]；西葫蘆中在含低類胡蘿卜素的種質中高表達，在高類胡蘿卜素的種質中低表達[38]；RNA干擾（RNAi）菊花中的表達，使白色菊花轉變為黃色[18]；桃中通過病毒誘導的基因沉默（VIGS）抑制白肉桃表達，結果在白肉桃中誘導出了黃色[39]，白色矮牽牛編碼區一段226 bp的MITE插入終止了的轉錄形成黃色突變[40]，甘藍中也有類似報道[41]，這些研究結果均表明高表達的會使果肉的顏色偏淺。陶俊[42]的研究也表明果肉偏紅色的‘溫州蜜柑’類胡蘿卜素含量顯著高于果肉偏黃色和淺橙色的‘甜橙’，由此進一步推測的高表達降低了柑橘果肉中類胡蘿卜素的含量，使果肉顏色偏黃。但‘茂谷柑’并不符合這一推測，因此，本研究對10個柑橘品種進行了測序分析。結果顯示，10個柑橘品種中并沒有發生結構變異，也沒有終止子突變，但‘茂谷柑’編碼區中含有較多的變異，其中A305T、V553I為其獨有的氨基酸變異，這可能是導致‘茂谷柑’的表達量與果肉顏色之間關系異常的原因，但還需要進一步的驗證。對30個柑橘品種進行單倍型分析，發現果肉呈橙紅色的品種中單倍型序列均以hap-1、hap-4、hap-5為優勢單倍型，而含有hap-4、hap-5的品種果皮均呈現艷麗的紅色。由此可見，根據的基因分型結果，不僅能夠為果肉顏色育種提供重要的分子標記，而且能夠對30份柑橘種質進行清晰的系譜分類。‘美國糖橘’來源較為復雜，至今不清楚其具體親本信息，在本試驗中其兩個單倍型分別為hap-1和hap-6，包含hap-1單倍型的種質多為中國系紅橘品種，而含有hap-6單倍型的品種為雜柑類品種，由此推測‘美國糖橘’可能為紅橘與雜柑類品種雜交而成。另外引人注意的是，hap-5僅有一個品種‘牛肉紅橘’，其為‘朱紅橘’突變體[43]，本試驗中鑒定到其包含兩種單倍型，相較于其他‘朱紅橘’品種，‘牛肉紅橘’的果肉為濃郁的橙紅色，其果皮顏色也為深紅色。結合在中669 bp為Y的基因型均表現為果皮艷麗的紅色，果肉為橙紅色，669 bp位置的C/T基因型可作為潛在的柑橘顏色育種的分子標記。綜合本試驗結果，的hap-1、hap-4、hap-5單倍型作為分子標記來預測柑橘果肉顏色，hap-4、hap-5和669 bp的C/T基因型來預測柑橘果皮顏色值得關注，下一步將通過對該單倍型遺傳規律的深入研究予以進一步驗證。

4 結論

本研究從柑橘全基因組中鑒定出14個CCD基因成員，其蛋白均含有RPE65保守結構域。亞細胞定位顯示CcCCD定位于細胞質和葉綠體。的表達水平影響柑橘果肉顏色的表現，高表達的品種果肉顏色普遍較淺，而低表達品種果肉顏色普遍較深。因此，可作為潛在的柑橘果實顏色的輔助育種標記，尤其是單倍型hap-1、hap-4和hap-5與果肉紅色的關聯度較高，對柑橘顏色育種的早期雜種群體篩選具有一定幫助。

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Genome Wide Identification of CCD Gene Family in Citrus and Effect ofon the Color of Citrus Flesh

ZHANG YaFei1, PENG Jie1, ZHU YanSong1, YANG ShengNan1, WANG Xu1, ZHAO WanTong1, 2, JIANG Dong1, 2

(1Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712;2Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712)

【】To reveal the distribution, structure and evolution of carotenoid cleavage dioxygenas gene family in the citrus genome (CcCCD), this study were performed to develope marker-assisted selection of flesh color in citrus breeding program, bioinformatics predication, expression analysis and genotype ofin flesh color development and different germplasm accessions. 【】The CCD gene family ofgenome were identified by homologous search according to previously reported CCD in other plant species. Phylogenetic analysis, subcellular localization prediction, relative molecular weight, theoretical isoelectric point (PI), conserved motif prediction, and scaffold location were studied by bioinformatics methods. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to study the expression ofin 10 citrus accessions during the flesh color development period. Haplotype analysis was performed by Tassel software after sequencing ofin 30 citrus varieties.【】Fourteen CCD family genes were found in thegenome, and these genes could be divided into five subfamily, namely,CcCCD1, CcCCD4, CcCCD7, CcCCD8 and CcNCED. Its theoretical isoelectric point were 6.05 to 8.53 and these CCD family genes encoded 412-611 amino acids. The subcellular localization prediction indicated that CcCCD genes mainly were located in chloroplast and cytoplasm. Phylogenetic analysis showed thatgenes in citrus were also found in other plant species. Obviously, CCD8 subfamily had farther genetic distance with other CCD. Scaffold localization analysis showed that 14 CcCCD members were unevenly distributed in all scaffolds except scaffold 5. The phenotyping of flesh color in 10 citrus varieties demonstrated that the hue angle of flesh color was decreased along with fruit maturing. The relative expression ofin different citrus varieties was significantly different. The expression ofin the flesh color of orange red was significantly lower than that in the flesh color of orange or light orange yellow (＜0.05). There was a significant positive correlation between the relative expression ofand the hue angle during fruit ripening. Genotyping ofin 30 citrus varieties revealed that hap-1, hap-4 and hap-5 were dominant haplotype at orange red flesh varieties. 【】The whole genome ofcontained 14 members of CCD gene family.All these CCD gene family members contained RPE65 conserved domain, but they were located in different cell components and unevenly distributed at different scaffolds.was involved in the development of citrus flesh color, and there was a significant positive correlation between its relative expression and the hue angle. Therefore,could be used as potential marker for citrus fruit color breeding. Especially, hap-1, hap-4 and hap-5 had a high correlation with the phenotypes of orange red flesh, which might be helpful for selecting candidate hybrids in early stage of citrus breeding program.

citrus; CCD gene family;; flesh color; gene expression; haplotype

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.014

2019-01-10；

2020-03-03

國家重點研發計劃（2018YFD1000101）、教育部雙一流學科建設項目

張亞飛，E-mail：1065120362@qq.com。通信作者江東，E-mail：jiangdong@cric.cn

（責任編輯 趙伶俐）