大豆重組自交系群體異黃酮含量QTL連鎖定位與關聯定位的比較研究

劉再東，孟珊，賀建波，邢光南，王吳彬，趙團結，蓋鈞鎰

大豆重組自交系群體異黃酮含量QTL連鎖定位與關聯定位的比較研究

劉再東，孟珊，賀建波，邢光南，王吳彬，趙團結，蓋鈞鎰

（南京農業大學大豆研究所/國家大豆改良中心/農業部大豆生物學與遺傳育種重點實驗室/作物遺傳與種質創新國家重點實驗室/江蘇省現代作物生產協同創新中心，南京 210095）

【】異黃酮是大豆等豆類植物中富含的一類次生代謝產物，對食品和保健產業有重要作用。大豆籽?？煞蛛x出12種異黃酮組分，可歸為三大類：大豆苷類異黃酮、染料木苷類異黃酮和黃豆苷類異黃酮。通過鑒定大豆籽粒異黃酮總含量及3個組分含量性狀的加性及上位性QTL，進而全面解析其復雜的遺傳構成。利用先進2號和趕泰2-2雙親衍生的大豆重組自交系群體NJRSXG，在5個環境下測定4個異黃酮含量性狀：異黃酮總含量（total isoflavone content，SIFC）、大豆苷類異黃酮總含量（total daidzin group content，TDC）、染料木苷類異黃酮總含量（total genistin group content，TGC）和黃豆苷類異黃酮總含量（total glycitin group content，TGLC）。選用混合模型復合區間作圖法（mixed-model-based composite interval mapping，MCIM）和限制性兩階段多位點全基因組關聯分析方法（restricted two-stage multi-locus genome-wide association analysis，RTM-GWAS）進行異黃酮含量QTL檢測。2個親本在4個異黃酮含量性狀上均存在較大差異，重組自交系群體異黃酮含量在高值、低值2個方向上均出現超親分離，低值方向分離趨勢強于高值方向。利用連鎖定位MCIM方法共檢測到4個異黃酮含量性狀的19個加性QTL和16對上位性QTL，分布于15條染色體上。第14染色體重要標記區間GNE186b—Sat020內檢測到3個新加性QTL：、和，且表型變異解釋率最高。利用關聯定位RTM-GWAS方法分別檢測到4個異黃酮含量性狀的51、66、42和36個關聯標記位點，表型變異解釋率為39.7%—52.5%，檢測到的位點中覆蓋了MCIM方法檢測的19個加性QTL中的11個以及11個上位性QTL。候選基因分析分別在加性QTL區域和上位性QTL區域檢測到93和100個候選基因，富集分析顯示在第14染色體重要標記區間GNE186b—Satt020內，、和的功能與異黃酮代謝有關。連鎖定位和關聯定位2種方法結合能相對全面地檢測異黃酮含量QTL。與連鎖定位方法MCIM相比，關聯定位方法RTM-GWAS檢測的QTL更多，總遺傳貢獻率更高，但尚不能檢測上位性QTL，2種方法定位結果可相互驗證補充，大豆籽粒異黃酮含量由大量QTL/基因控制。

大豆；重組自交系群體；異黃酮；連鎖作圖；關聯定位；QTL

0 引言

【研究意義】異黃酮是一類重要的次級代謝產物，在大豆和其他豆類植物中含量較為豐富。異黃酮作為一種抗菌劑可以防御病原體和害蟲對植物的入侵[1-2]，醫學研究顯示人體每天攝入異黃酮可以預防前列腺癌、乳腺癌和骨質疏松癥等疾病[3-4]。據報道，與大豆籽粒蛋白質和油脂含量相比，異黃酮總含量較低，僅為416—6 808 μg·g-1[5]。因此，培育高異黃酮含量大豆品種有利于食品和保健產業?！厩叭搜芯窟M展】大豆籽粒中可分離出12種異黃酮組分，依據苯環配基差異可歸為三大類：大豆苷類異黃酮、染料木苷類異黃酮和黃豆苷類異黃酮，三類異黃酮的含量比例通常保持在4﹕5﹕1[6]。每類異黃酮再結合葡萄糖、乙酰葡萄糖和丙二酰葡萄糖形成相應的糖苷[2]，其中，葡萄糖苷和乙酰葡萄糖苷在高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析中含量較低，通常認為它們是樣品預處理期間丙二酰葡萄糖苷的降解產物[7]。三類異黃酮的功能也存在一定差異。大豆苷類異黃酮的代謝產物雌馬酚可以治療乳腺癌，染料木苷類異黃酮作為某種酶的誘導劑有助于治療動脈硬化[8]，黃豆苷類異黃酮可以抑制成骨細胞的增殖以治療骨質疏松癥[9-10]。目前，多數研究報道了大量大豆籽粒異黃酮含量QTL（quantitative trait locus）分布于所有大豆染色體上[11-18]。Liang等[11]利用包含474個家系的重組自交系群體，檢測到6個異黃酮含量QTL，分布在大豆4條染色體上。Wang等[13]利用重組自交系群體檢測到34個異黃酮含量QTL，其中23個QTL為新發現位點，在Satt186與Satt226間的QTL在4個環境中均被檢測到，表型變異解釋率為3.4%—11.0%。Zhang等[16]檢測到22個異黃酮含量QTL，分布在大豆8條染色體上，表型變異解釋率為4.5%—7.9%，同時檢測到3對異黃酮含量上位性QTL，其中，和影響黃豆黃苷含量，影響大豆異黃酮總含量。Zeng等[19]使用單因素方差分析和按性狀分型的方法同時分析了加性以及加性與環境互作QTL。Gutierrez-Gonzalez等[20-22]使用混合模型復合區間作圖法（MCIM）鑒定了一些在不同環境中均能穩定影響異黃酮含量的主效QTL。Li等[23]基于大豆重組自交系群體檢測到48個加性QTL，表型變異解釋率為3.0%—29.8%，其中，與黃豆苷類、染料木苷類和總異黃酮含量有關的8個QTL均被定位于A1連鎖群的相同區域內，且表型變異解釋率均大于14.0%，并經不同群體定位分析得以驗證。Pei等[24]利用包含3 541個SLAF標記的高密度遺傳圖譜，在4個環境中檢測到24個異黃酮含量QTL，其中，包括與染料木苷、丙二酰大豆苷、丙二酰染料木苷和總異黃酮含量相關的各1個新的QTL，另外還檢測到9個上位性QTL。Cai等[25]通過構建高密度遺傳圖譜，于多環境下檢測到15個異黃酮含量QTL，分布在大豆10條染色體上。異黃酮含量是由許多微效QTL控制的復雜數量性狀，其中大部分QTL難以定位到遺傳連鎖圖譜上，此外異黃酮含量在不同環境中的表型變異也是不穩定的[18-20]。目前，關于異黃酮相關基因、與異黃酮合成關鍵酶相互作用的轉錄因子的研究已有不少報道[26-28]，朱瑩等[26]克隆了一個與大豆異黃酮合成相關的R2R3類型MYB轉錄因子GmMYB184，驗證了該轉錄因子對異黃酮合成途徑關鍵基因的轉錄激活活性及其在異黃酮合成中的正向調控作用。Chu等[27]利用關聯分析方法檢測到與異黃酮含量顯著相關的28個SNP標記及一個候選基因，并證明通過激活（異黃酮合酶2）和（查爾酮合成酶8）啟動子，進而調控異黃酮含量。Vadivel等[28]研究表明轉錄因子GmMYB176通過激活的表達進而調控異黃酮的合成?！颈狙芯壳腥朦c】全面解析異黃酮含量的遺傳結構有助于了解大豆籽粒異黃酮含量的遺傳模式并培育高異黃酮含量大豆新品種。獲得可靠穩定的QTL是分子標記輔助育種的第一個重要步驟，由于不同的QTL檢測方法對異黃酮含量的遺傳解析效果不盡相同，因此，有必要比較不同定位方法以便使用更高效的統計模型在多種環境中檢測異黃酮含量QTL。連鎖定位MCIM方法基于多環境表型數據，不僅可以檢測加性QTL和上位性QTL，還能夠檢測與環境互作QTL[29]。Pan等[30]基于大豆重組自交系群體全基因組SNP分子標記和開花期數據，比較了不同QTL定位方法和不同標記類型在QTL定位中的應用效果。結果顯示基于SNP連鎖不平衡區塊（SNP linkage disequilibrium block，SNPLDB）標記的限制性兩階段多位點全基因組關聯分析（restricted two-stage multi- locus genome-wide association analysis，RTM-GWAS）方法[31-32]不僅能檢測較多的QTL，而且能合理估計QTL表型變異解釋率，更適用于重組自交系群體。因此，連鎖定位MCIM方法和關聯定位RTM-GWAS方法的聯合分析可能為全面解析異黃酮含量QTL提供新思路。【擬解決的關鍵問題】本研究在5個環境中，同時采用連鎖定位MCIM方法和關聯定位RTM-GWAS方法解析重組自交系群體NJRSXG異黃酮總含量（total isoflavone content，SIFC）、大豆苷類異黃酮總含量（total daidzin group content，TDC），染料木苷類異黃酮總含量（total genistin group content，TGC）和黃豆苷類異黃酮總含量（total glycitin group content，TGLC）4個異黃酮含量性狀的遺傳結構，并鑒定其加性QTL、上位性QTL以及與環境互作QTL。

1 材料與方法

1.1 材料與田間試驗

以先進2號（異黃酮含量高）和趕泰-2-2（異黃酮含量低）為親本，采用單粒傳法衍生了包含147個家系的重組自交系群體NJRSXG。到2009年種植時，該群體處于F2:8:14世代。

供試材料為NJRSXG群體及其親本，田間試驗分別于2009、2010和2011年夏季在南京農業大學江浦農學試驗站進行（長江以北），其中2009年夏季同時在南京農業大學溧水大豆試驗點進行（長江以南）。另外，2010年在江浦同時進行了晚播試驗，播種日期比同年正常日期推遲一個月，一些非生物脅迫如光照、時間和土壤水分在正常播種和晚播材料之間存在顯著差異。因此，涉及5個環境，試驗設計均采用完全隨機區組設計，2次重復，穴播，每穴作為一個小區，每穴定苗8株，穴距0.8 m。每個小區內隨機挑選100粒干燥成熟種子用于異黃酮含量測定。

1.2 異黃酮含量測定

參考王春娥等[33]方法進行異黃酮提取與含量測定。使用FOSS 1095 Knifetec研磨器將每份種子樣品磨成細粉。樣品分為2份，一份用于含水量測定（105℃，≥5 h）；另一份用于提取異黃酮。將15 mg樣品于2 mL微型離心管中，加入1.5 mL 80%（v/v）甲醇，50℃超聲輔助提取1 h，冷卻至室溫后，將提取物以12 000 r/min離心10 min。將上清液通過Whatman 0.45-μm 25-mm PTFE有機相針式濾器過濾，取10 μL濾液使用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm, 5 μm）通過Agilent 1100反相HPLC進行分析，柱溫為50℃，流速為2.0 mL·min-1。流動相A為0.1%（v/v）乙酸，流動相B為100%甲醇。梯度洗脫為：0—2 min（27%B），2—3 min（27%—36%B），3—6 min（36%B），6—7min（36%—33%B），7—13 min（33%B），13—14 min（33%—27%B）和14—15 min（27%B）。檢測波長為254 nm（DAD檢測器，Agilent，美國）。

采用外標法定量異黃酮，使用12種異黃酮標準品。以每克干大豆籽粒異黃酮含量為指標（單位為μg·g-1）。共定量了4個異黃酮含量性狀，分別為異黃酮總含量（SIFC）、大豆苷類異黃酮總含量（TDC）、染料木苷類異黃酮總含量（TGC）和黃豆苷類異黃酮總含量（TGLC）。SIFC為TDC、TGC和TGLC之和。TDC為大豆苷元（Daidzein）、大豆苷（Daidzin）、乙?；蠖管眨?’-O-acetyldaidzin）和丙二酰基大豆苷（6’-O-malonyldaidzin）含量之和。TGC為染料木苷元（Genistein）、染料木苷（Genistin）、乙酰基染料木苷（6’-O-acetylgenistin）和丙二酰基染料木苷（6’-O-malonylgenistin）含量之和。TGLC為黃豆苷元（Glycitein）、黃豆苷（Glycitin）、乙酰基黃豆苷（6’-O-acetylglycitin）和丙二?；?’-O- malonylglycitin）黃豆苷含量之和。

1.3 遺傳連鎖圖譜構建

NJRSXG群體遺傳連鎖圖由國家大豆改良中心和中國科學院遺傳與發育生物研究所共同構建[34]。使用來自SoyBase（http://soybase.org）的937個SSR標記，以及設計的540個EST-SSR和231個BAC-SSR，共1 732個分子標記篩選多態性，獲得447個差異標記位點。最后使用JoinMap軟件[35]將400個標記（285個SSR、74個EST-SSR和68個BAC-SSR）整合到一張連鎖圖譜中。遺傳連鎖圖譜由23個連鎖群組成，全長1 447.9 cM，標記平均間距為3.9 cM，標記順序與大豆公共遺傳連鎖圖譜[36]基本一致。

1.4 統計分析

根據如下線性模型進行多環境聯合方差分析：

其中，為群體平均數，e為第個環境效應，r(i)為第個環境內第個區組的效應，g為第個基因型效應，()為基因型與環境互作效應，ε為隨機誤差。使用SAS軟件[37]的PROC GLM進行聯合方差分析，其中，環境、區組（環境）、基因型、基因型與環境互作，均視為隨機效應。

1.5 QTL定位

采用混合線性模型復合區間作圖法（MCIM）進行加性QTL、上位性QTL以及與環境互作加性和上位性QTL檢測。利用QTLNetwork軟件進行MCIM方法計算，以排列測驗1 000次的值為統計檢驗閾值檢測QTL，基因組掃描窗口大小為10 cM，步長為1 cM，其他參數保持默認。同時，還采用He等[31-32]發展的限制性兩階段多位點全基因組關聯分析（RTM-GWAS）方法，檢測異黃酮含量關聯標記位點，QTL檢測顯著水平設0.01。RTM-GWAS方法基于多位點模型，同時能夠檢測與環境互作QTL。比較來自不同作圖方法的結果時，若不同方法定位到的某兩QTL間的遺傳距離小于5 cM，則認為此兩QTL是相同的，該位點被不同方法同時檢測到[38-40]。

2 結果

2.1 異黃酮組分性狀的表型變異

次數分布表及頻率分布圖顯示4個異黃酮含量性狀呈連續性變化，為數量性狀特征（表1和圖1）。NJRSXG群體2個親本間存在顯著差異，母本先進2號是異黃酮含量極高的大豆栽培品種，異黃酮總含量（SIFC）為6 302 μg·g-1，而父本趕泰-2-2的異黃酮總含量僅為3 401 μg·g-1。整體來看，群體在低值、高值2個方向上都出現了超親分離，4個異黃酮含量性狀低值方向的超親分離趨勢均強于高值方向（其中TGLC在高值方向未發現有超親分離現象）。多環境聯合方差分析顯示，家系間異黃酮含量性狀變異遠大于家系與環境互作的變異，即使后者差異顯著，但值不大，表明這些異黃酮含量性狀在不同環境中表現相對一致。異黃酮含量性狀遺傳率極高，異黃酮總含量（SIFC）的遺傳率為94.1%，大豆苷類異黃酮總含量（TDC）、染料木苷類異黃酮總含量（TGC）和黃豆苷類異黃酮總含量（TGLC）的遺傳率為92.7%—95.4%。

表1 異黃酮含量（102 μg·g-1）的次數分布

SIFC：異黃酮總含量；TDC：大豆苷類異黃酮總含量；TGC：染料木苷類異黃酮總含量；TGLC：黃豆苷類異黃酮總含量；N：家系數；P1：先進2號；P2：趕泰-2-2；GCV：遺傳變異系數；2：廣義遺傳率。下同

SIFC: total isoflavone content; TDC: total daidzin group content; TGC: total genistin group content; TGLC: total glycitin group content; N: the number of lines; P1: Xianjin 2; P2: Gantai-2-2; GCV: genetic coefficient of variation;2: broad sense heritability. The same as below

SIFC：異黃酮總含量；TDC：大豆苷類異黃酮總含量；TGC：染料木苷類異黃酮總含量；TGLC：黃豆苷類異黃酮總含量。下同

異黃酮含量性狀間具有不同程度相關性（表2）。4個異黃酮組分性狀，異黃酮總含量（SIFC）、大豆苷類異黃酮總含量（TDC）、染料木苷類異黃酮總含量（TGC）和黃豆苷類異黃酮總含量（TGLC）之間均呈正相關，SIFC與TDC、TGC相關系數分別為0.95和0.97，而與TGLC之間的相關性略低，相關系數為0.39。TDC、TGC和TGLC之間的相關性相對較低，相關系數分別為0.26和0.32，表明大豆苷類和染料木苷類異黃酮的生物合成和遺傳變異相似，這兩種成分對異黃酮總含量有顯著影響，而黃豆苷類異黃酮的合成和變異有其自身的特點，這也暗示具有高度顯著相關性的不同性狀的一些QTL可能共享相同的基因組區域。

表2 異黃酮含量性狀間相關系數

SIFC：異黃酮總含量；TDC：大豆苷類異黃酮總含量；TGC：染料木苷類異黃酮總含量；TGLC：黃豆苷類異黃酮總含量。**表示0.01顯著性水平測驗顯著。下同

SIFC: total isoflavone content; TDC: total daidzin group content; TGC: total genistin group content; TGLC: total glycitin group content. ** represents significance at level of 0.01. The same as below

2.2 異黃酮含量的連鎖定位

MCIM方法共檢測到4個異黃酮總含量（SIFC）加性QTL和15個異黃酮組分含量（TDC、TGC和TGLC）的加性QTL（表3）。加性效應的總貢獻率為15.9%（TGLC）—27.3%（TGC），上位性效應的總貢獻率為1.0%（SIFC）—15.4%（TGLC）。而性狀遺傳率遠大于其加性和上位性QTL的總貢獻率，表明許多未被定位到的QTL貢獻了大部分遺傳率。單個QTL的表型變異解釋率為0.2%—10.6%，其中和的貢獻率均超過10.0%，并且被定位在相同標記區間GNE186b—Satt020內（表4）。此外，MCIM方法檢測到與SIFC相關的1對上位性QTL，與其余3個組分含量性狀相關的共15對上位性QTL，其表型變異解釋率為0.2%—4.6%。

表3 異黃酮含量MCIM方法遺傳解析

Table 3 The genetic dissection of isoflavone content architecture

括號內數字為QTL個數或對數；2：遺傳率；Add.：加性；Epi.：上位性

Number in parentheses is the number of QTLs or QTL pairs;2: heritability; Add.: additive; Epi.: epistatic

MCIM方法檢測到與SIFC相關的4個加性QTL，分布在第3、14、18和19染色體上，QTL表型貢獻率為4.2%—10.6%，合計25.8%（表4）。其中，的貢獻率在5種環境中均超過10.0%。僅發現1對上位性QTL，表型貢獻率為1.0%。上位性QTL的貢獻率僅占SIFC遺傳率（94.1%）的微小部分，未檢測到的QTL總貢獻率約為67.3%。檢測到與TDC相關的5個加性QTL，分布于第3、8、14和18染色體上，QTL表型貢獻率為2.3%—8.7%，合計23.7%。對每個單環境進行分析，也檢測到了，表型貢獻率為8.7%。共檢測到6對上位性QTL，分布于9條染色體上，總貢獻率為12.4%。加性QTL的總貢獻率幾乎是上位性QTL的2倍。檢測到的QTL總貢獻率為36.1%，未檢測到的QTL解釋了超過一半的表型變異。與TGC相關的6個加性QTL分布在第3、13、14、18和19染色體上，表型貢獻率為0.2%—10.3%，總計27.3%。其中，的貢獻率為10.3%，且在5種環境中都發現了該位點。同時檢測到4對上位性QTL，分布在6條染色體上，總貢獻率為5.4%。加性QTL的總貢獻率遠大于上位性QTL，兩者累積為32.7%，未檢測到的QTL解釋了約60.0%的表型變異。檢測到與TGLC相關的4個加性QTL，分布在第6、8、10和17染色體上。表型貢獻率為2.9%—5.3%，總計15.9%。在7條染色體上檢測到5對上位性QTL，總貢獻率為15.4%。加性效應的總貢獻率與上位性效應幾乎相同，2種貢獻率的總和為31.3%，小于未被定位的QTL總貢獻率。

圖2顯示了異黃酮總含量（SIFC）及3個組分總含量（TDC、TGC和TGLC）性狀中重疊的QTL或基因組區域。第3染色體上的Satt521—GNE324、第8染色體上的Satt089—Satt525、第14染色體上的GNE186b—Satt020、第18染色體上的Satt038—Sat_168及第19染色體上的Satt481—GNE091區間是主要的加性QTL區域，每個區域均包含不同性狀的QTL，與SIFC相關的4個加性QTL全部位于主要區域內。第14染色體上的GNE186b—Sat020區域最為重要，位于該區域的3個加性QTL，、和在對應性狀中均具有最高的貢獻率，3個QTL的加性效應均為負，表明低異黃酮含量親本趕泰-2-2為提高SIFC，TDC和TGC含量各提供了一個等位基因。而第1染色體上的Sat_353—Satt532b、第10染色體上的GNB134—Sat_282和GNE061—GNB130、第12染色體上的GNE229—Satt192、第14染色體上的Satt304—Sat_355和第17染色體上的Sat_022—Satt186標記區間是主要上位性QTL區域，每個區域內主要包括SIFC和TGC的上位性QTL，或者TDC和TGLC的上位性QTL。值得注意的是在11個主要QTL區域，除加性QTL區域內同時具備上位性外，其余區域內的QTL只有加性或上位性效應。

加粗位點表示同時為RTM-GWAS方法所檢測到。2Add：加性QTL表型變異解釋率；2Epi：上位性QTL表型變異解釋率

Locus in bold style is also detected by RTM-GWAS.2Add: phenotypic variation explained by additive QTL;2Epi: phenotypic variation explained by epistatic QTL

環形代表主要的加性QTL區域，三角形代表主要的上位性QTL區域，連接2個QTL的直線代表上位性效應

2.3 異黃酮含量多位點關聯分析

利用限制性兩階段多位點全基因組關聯分析（RTM-GWAS）方法分別檢測到51、66、42和36個與異黃酮總含量（SIFC）、大豆苷類異黃酮總含量（TDC）、染料木苷類異黃酮總含量（TGC）和黃豆苷類異黃酮總含量（TGLC）關聯的標記位點（圖3），總表型變異解釋率（包括位點主效和位點與環境互作效應）分別為44.4%、52.5%、39.7%和45.6%（表5），其中位點主效表型變異解釋率為34.9%（TGC）—47.0%（TDC），位點與環境互作效應表型變異解釋率為2.3%（TGLC）—5.5%（TDC）。可見，異黃酮含量主要由主效位點控制，與環境互作效應相對較小，這與MCIM方法結果一致。

RTM-GWAS方法檢測的51個異黃酮總含量（SIFC）位點中，45個位點主效顯著，21個位點與環境互作效應顯著，17個位點2種效應皆顯著。51個位點覆蓋了MCIM方法檢測的4個加性QTL中的3個，分別為、和，覆蓋率為75%。然而，這3個QTL在RTM-GWAS中的貢獻率相對較小，其中對應的Satt556標記位點表型變異解釋率最高，也僅為1.8%，但在MCIM中其解釋率高達10.6%。而RTM-GWAS方法檢測結果中第13染色體上標記位點Satt030的表型變異解釋率最高，為6.3%。此外，RTM-GWAS方法檢測的位點還覆蓋了MCIM方法檢測的一個上位性QTL。與大豆苷類異黃酮總含量（TDC）關聯的66個位點中，60個位點主效顯著，30個位點與環境互作效應顯著，28個位點2種效應皆顯著。66個位點覆蓋了MCIM方法檢測的5個加性QTL中的4個，以及4個上位性QTL，加性QTL的覆蓋率高達80%。標記位點GNE186b的表型變異解釋率最高，為8.6%，該位點對應的加性效應遺傳率也最高，為8.7%。然而加性效應遺傳率也較高為5.8%，但是與其對應的標記位點Sat_210表型變異解釋率僅為0.4%。與染料木苷類異黃酮總含量（TGC）關聯的42個位點中，40個位點主效顯著，18個位點與環境互作效應顯著，16個位點兩種效應皆顯著。42個位點僅覆蓋了MCIM方法檢測的6個加性QTL中的2個，分別為標記位點Satt521對應的和Satt020對應的。的加性效應遺傳率最高，為10.3%，而標記位點的Satt020的表型變異解釋率相對較低，為2.8%。另外，RTM-GWAS方法檢測的位點還覆蓋了MCIM方法檢測的兩個上位性QTL。與黃豆苷類異黃酮總含量（TGLC）關聯的36個位點主效全部顯著，其中有7個位點與環境互作效應顯著。36個位點覆蓋了MCIM方法檢測的4個加性QTL中的2個，分別為標記位點GNB215a對應的和Sat_140對應的。的加性效應遺傳率最高，為5.3%，與其對應的標記位點GNB215a的表型變異解釋率也最高，為5.0%。Sat_140的表型變異解釋率也較高，為3.5%。另外，RTM-GWAS方法檢測的位點還覆蓋了MCIM方法檢測的4個上位性QTL。

2.4 大豆籽粒異黃酮含量候選基因

異黃酮含量的主要候選基因可以根據11個主要加性和上位性QTL區域推測。最終在主要加性QTL區域和主要上位性QTL區域分別檢測到93和100個候選基因?；蚋患治鼋Y果顯示這193個候選基因涉及21個生物學過程，主要與運輸、信號轉導、碳水化合物代謝等過程相關，表明控制異黃酮含量的基因體系包含與多種生物代謝過程相關的一系列基因（圖4）。值得注意的是，在最重要的第14染色體加性QTL區域GNE186b—Satt020，3個基因、和的功能與異黃酮代謝有關，其中參與了類黃酮生物合成過程。

圖3 異黃酮含量關聯分析

3 討論

3.1 與前人QTL定位結果的比較

整合在NJRSXG群體遺傳圖譜中的一些BAC- SSR標記不能錨定在大豆公共連鎖圖譜上，因此，必須使用前人和本研究中共有的標記來比較結果，當2個位點的物理距離小于2 Mb時，該位點被認為是相同的QTL。本研究19個異黃酮含量QTL中，9個QTL為新位點。其中黃豆苷類異黃酮總含量（TGLC）QTL的標記區間為Satt079—GNB215a，而根據大豆的公共遺傳圖譜[36]，在Gutierrez-Gonzalez等研究中[21]，的左側標記Satt319與Satt079相距約4 cM。Kassem等[41]在第8染色體上鑒定到的QTL位點，位于Sat_129（位置，84.08 cM）和Satt097（122.05 cM）內，而本研究中的右側標記Satt525（96.97cM）位于該區間內。Gutierrez-Gonzalez等[22]報道了第17染色體上，在Satt186和Sat_086（118.66 cM）之間定位的QTL位點，而在本研究中檢測到的的標記區間Satt397（69.30 cM）—Satt_220（128.73 cM）覆蓋，該位點具有候選基因的一個拷貝[21]。Yang等[14]在第3染色體上定位到SIFC的一個QTL位點，其臨近的標記Satt521與本研究中的左側標記相同，而另一個位于第12染色體上的QTL位點與本研究檢測到的處于相同的標記區間內。根據大豆公共圖譜，Yoshikawa等[15]定位到一個SIFC的QTL位點，與其相鄰的標記Satt066位置是78.8 cM，而的右側標記Satt020（72.10 cM）與其相距約6 cM，其中，與TGLC相關的一個QTL位點與本研究中的位置重疊，而與其定位到的相距較遠，為2個不同的位點。此外，Gutierrez-Gonzalez等[20-22]和Zeng等[19]也檢測到異黃酮含量的上位性QTL，本研究16對上位性QTL中，無任意1對與前人結果一致。然而其中10個上位性QTL（如和）的位置與前人定位的加性QTL位置一致（表4），這是否具有實際意義還需要進一步驗證。

表5 異黃酮含量關聯標記/QTL

Table 5 Marker/QTL detected for isoflavone component traits

僅列出大效應位點以及與MCIM方法重疊的位點，加粗位點表示同時為MCIM方法所檢測到加性位點，*表示同時為MCIM所檢測到的上位性位點。標記/QTL列總和數分別表示RTM-GWAS方法檢測的位點總數、覆蓋MCIM方法所檢測到的加性和上位性位點數目及其總數，例如51 (3/4;1/2)表示RTM-GWAS方法共檢測到51個位點，覆蓋MCIM方法所檢測的4個加性位點中的3個，2個上位性位點中的1個。-lg列的總和數為總位點數。LC和SC QTL分別表示大貢獻（2≥1%）和小貢獻（2＜1%）QTL；2：表型變異解釋率；a：QTL檢測模型顯著性測驗；b：QTL與互作效應

Only loci of large contribution or overlapping with MCIM result were showed. Locus in bold style is also detected as additive QTL by MCIM, * is also detected as epistatic QTL by MCIM. The total number in marker/QTL column represent the number of loci detected by RTM-GWAS, and the number of additive and epistatic QTL overlapped with MCIM, for example, 51 (3/4; 1/2) means a total of 51 loci are detected by RTM-GWAS covering 3 additive and 1 epistatic QTLs detected by MCIM, while 4 and 2 are the total number of additive and epistatic QTL detected by MCIM. Total numbers in column -lgare the number of loci. LC and SC QTL represent large (2≥1%) and small (2＜1%) contribution QTL;2: phenotypic variance explained;a: statistical hypothesis testing performed in QTL detection model;b: QTL-by-environment interaction effect

圖4 大豆籽粒異黃酮含量候選基因生物學過程分布

3.2 異黃酮含量QTL體系

本研究中異黃酮含量的遺傳方差由廣義遺傳率（來自方差分析）估計，方差來源于3部分，加性QTL效應，上位性QTL效應和未被定位的QTL效應。未被定位到的QTL的存在有如下原因：首先，未定位到的QTL確實為一些效應非常小的微效QTL，這種假設符合前人提出的“數量性狀的主基因加多基因模型”[42]。另一方面，MCIM方法未定位到的QTL可能在其他作圖群體或NJRSXG的改良群體中被檢測到。因此，遺傳學家必須使用具有較大樣本量和高密度分子標記的不同群體來鑒定可靠的QTL，并以多種策略將連鎖分析和關聯分析相結合[43-45]。

4個異黃酮含量性狀未定位到的總QTL解釋率為59.3%—67.3%，占一半以上的遺傳變異，這表明未被定位到的QTL在異黃酮含量的遺傳中起主導作用，這將會給育種實踐帶來一定困難。但是，2個新的加性QTL（和）解釋了超過相應性狀10.0%的遺傳變異，且還位于相同區域，該區域具有候選基因、和，且該主要遺傳區域經關聯分析研究得到驗證，它可為異黃酮總含量（SIFC）和染料木異黃酮總含量（TGC）的分子標記輔助育種提供重要信息。此外，異黃酮總含量（SIFC）、大豆苷類異黃酮總含量（TDC）和染料木異黃酮總含量（TGC）的加性效應都遠大于對應的上位性效應，而在黃豆苷類異黃酮總含量（TGLC）中，加性與上位性效應相當，表明黃豆苷類異黃酮的生物合成依賴于復雜的代謝網絡，其合成途徑在很大程度上仍然是未知的[46]。

異黃酮是源自苯丙烷類和類黃酮途徑的次級代謝產物，可被包括非生物和生物脅迫在內的多種環境因素誘導[46]，因此有必要設計多環境試驗，從而經多環境聯合分析以確定異黃酮的可靠遺傳區域。除利用MCIM方法進行數據聯合分析外，本研究還在5個環境下分別檢測加性QTL（數據略），在19個加性QTL中，單個環境中共鑒定到了12個。第14染色體主要加性QTL區域GNE186b—Satt020上的3個QTL（、和），在5個環境中均被檢測到，表明該遺傳區域對SIFC、TDC和TGC的表型變異有穩定的遺傳貢獻。在4個、3個、2個和1個環境中檢測到的QTL數量分別為0、3、1和5，說明這些QTL的效應可能是由某些特定的環境脅迫引起的。

目前，在大豆異黃酮基因的研究方面，已知不少與異黃酮合成有關的基因，應用分子生物學手段一些基因的功能已得到驗證，本研究在第14染色體GNE186b—Satt020區域內定位到2個新的加性QTL（和），并預測同區域內的3個基因、和的功能與異黃酮代謝有關，其中參與了類黃酮生物合成過程，而關于這三個基因的詳細功能仍是未知的，有待進一步研究。

3.3 連鎖定位與關聯定位的比較和互補

MCIM方法檢測的位點往往也能為RTM-GWAS方法所檢測到，位點表型貢獻率與MCIM方法相當或相對較小，RTM-GWAS方法同時也檢測到了其他大效應和小效應位點。MCIM方法共檢測到與4個異黃酮含量性狀（SIFC、TDC、TGC和TGLC）相關的6、17、13和12個QTL，而RTM-GWAS方法分別檢測到51、66、42和36個與對應性狀關聯的標記位點。與連鎖定位MCIM方法相比，關聯定位RTM-GWAS方法能夠檢測到更多的異黃酮含量QTL，且覆蓋了MCIM方法檢測的19個加性QTL中的11個。MCIM方法檢測的加性QTL總表型變異解釋率較低，為15.9%—27.3%，而RTM-GWAS方法所檢測位點的總表型變異解釋率為39.7%—52.5%。

然而，RTM-GWAS方法尚不能檢測上位性QTL，從MCIM方法檢測的4個異黃酮含量性狀的上位性QTL可以看出，異黃酮含量上位性QTL的效應較小，例如，異黃酮總含量（SIFC）上位性QTL貢獻率僅為1.0%，染料木異黃酮總含量（TGC）上位性QTL貢獻率為5.4%，并且異黃酮總含量（SIFC）、大豆苷類異黃酮總含量（TDC）和染料木異黃酮總含量（TGC）的加性效應均遠大于上位性效應。因此，對于本研究的4個異黃酮含量性狀，RTM-GWAS方法可以獲得更為全面的遺傳解析結果。

整合連鎖定位與關聯定位用于異黃酮含量的遺傳解析，不僅利用連鎖定位方法主效位點檢測功效高的優點，而且還能利用RTM-GWAS方法位點檢測功效高、遺傳解析較為全面的優勢，2種方法相互驗證，從而對分析結果做出更加準確的推斷。

4 結論

NJRSXG群體重組自交系中，異黃酮總含量（SIFC）、大豆苷類異黃酮總含量（TDC）、染料木異黃酮總含量（TGC）和黃豆苷類異黃酮總含量（TGLC）均出現超親分離現象。利用混合模型復合區間作圖法（MCIM）檢測到了4個異黃酮含量性狀的共19個加性QTL和16對上位性QTL，其中2個新發現的加性QTL解釋了超過相應性狀10.0%的遺傳變異。利用限制性兩階段多位點全基因組關聯分析方法（RTM-GWAS）檢測到51、66、42和36個與SIFC、TDC、TGC和TGLC關聯的標記位點，與4個異黃酮含量性狀MCIM結果有4、8、4和6個位點存在重疊，位點覆蓋率為25%—80%。連鎖定位方法MCIM在主效位點的檢測上具有較高的功效，而關聯定位方法RTM-GWAS檢測的QTL更多，總遺傳貢獻率更高，但尚不能檢測上位性QTL，連鎖定位和關聯定位2種方法結合能相對全面地檢測異黃酮含量QTL，2種方法定位結果可相互驗證補充，從而對異黃酮含量遺傳構成做出較為全面的推斷。大豆籽粒異黃酮含量由大量QTL/基因控制。

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A comparative study on linkage and association QTL mapping for seed isoflavone contents in a recombinant inbred line population of soybean

LIU ZaiDong, MENG Shan, HE JianBo, XING GuangNan, WANG WuBin, ZHAO TuanJie, GAI JunYi

(Soybean Research Institute, Nanjing Agricultural University/National Center for Soybean Improvement/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministry of Agriculture/State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210095)

【】Isoflavones are a group of phenolic secondary metabolites which are relatively abundant in soybean and some other legumes, and are important for food and healthcare industry. A total of 12 kinds of components are isolated from soybean seed, and can be grouped into three categories: daidzin group, genistin group and glycitin group. To understand the complex genetic constitutions of isoflavone content in soybean, the additive and epistatic quantitative trait loci (QTLs) conferring the total isoflavone content and its component contents were detected in the present study. 【】The NJRSXG recombinant inbred line (RIL) population derived from Xianjin 2 and Gantai-2-2 were used in this study. Four isoflavone content traits, i.e. the total seed isoflavone content (SIFC), the total daidzin group content (TDC), the total genistin group content (TGC) and the total glycitin group content (TGLC) were tested in five environments. The mixed model composite interval mapping (MCIM) and restricted two-stage multi-locus genome-wide association analysis (RTM-GWAS) were used for QTL detection. 【】There was a large difference in isoflavone content between the two parental lines of NJRSXG population, and transgressive segregations were observed in NJRSXG population while the transgressive trend in low isoflavone content direction were stronger than that in high isoflavone content direction.A total of 19 additive QTLs and 16 pairs of epistatic QTLs for the four isoflavone traits on 15 chromosomes were detected by MCIM. Three novel additive QTLs, i.e.,and, were detected in the same important marker interval GNE186b-Sat020 on chromosome 14, and explained the highest phenotypic variation. A total of 51, 66, 42 and 36 significantly associated markers were detected by RTM-GWAS for SIFC, TDC, TGC and TGLC, respectively. The phenotypic variation explained by these markers was ranged from 39.7% to 52.5%, covering 11 additive QTLs and 11 epistatic QTLs detected by MCIM. Furthermore, a total of 93 and 100 candidate genes were annotated in the additive and epistatic QTL regions, respectively. Gene enrichment analysis indicated that three genes located in the important marker interval GNE186b-Satt020 on chromosome 14, i.e.,and, were related to isoflavone metabolism. 【】A relatively thorough detection of isoflavone content QTLs was achieved by using linkage and association mapping. Compared with the linkage mapping method MCIM, the association mapping method RTM-GWAS can detect more QTLs with larger total contribution to phenotypic variation, but cannot detect epistatic QTLs as in MCIM. The QTLs detected from the two methods can be used for complementary verification from each other.A large number of QTLs/genes are involved in the seed isoflavone contents of soybean.

soybean [(L.) Merr.]; isoflavone; genetic dissection; linkage mapping; association mapping; QTL

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.006

2019-09-09；

2020-01-02

國家自然科學基金（31701447）、國家作物育種重點研發計劃（2017YFD0101500，2017YFD0102002）、長江學者和創新團隊發展計劃（PCSIRT_17R55）、教育部111項目（B08025）、中央高?；究蒲袠I務費項目（KYT201801）、農業部國家大豆產業技術體系CARS-04、江蘇省優勢學科建設工程專項、江蘇省JCIC-MCP項目

劉再東，E-mail：2714699171@qq.com。孟珊，E-mail：mshan84@163.com。劉再東和孟珊為同等貢獻作者。通信作者賀建波，E-mail：hjbxyz@gmail.com。通信作者蓋鈞鎰，E-mail：sri@njau.edu.cn

（責任編輯 李莉）