不同菌種發酵對藜麥蛋白質特性及脂質構成的影響

延莎，邢潔雯，王曉聞

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801）

0 引言

【研究意義】藜麥是一種莧科藜屬假谷物，原產于南美洲安第斯山區，由于其具有卓越的營養品質而被廣泛認可[1]。藜麥蛋白質含量為14%—16%，且是富含組氨酸和賴氨酸的優質蛋白質。淀粉是藜麥最主要的碳水化合物，含量為58.1%—64.2%，其次還富含膳食纖維[2]。藜麥的脂類含量約為6%，亞油酸、亞麻酸等必需脂肪酸的含量較其他谷類更為合理[3]。此外，藜麥富含各種礦物質、維生素和植物化學成分，是一種“全營養食品”[4]。聯合國糧農組織（FAO）指定藜麥為 21世紀能提供糧食安全的作物之一[3]。2014年以來，我國在山西、吉林、青海、甘肅和河北等省份開始較大規模種植藜麥[5]，然而藜麥在我國還屬于推廣初期，普通民眾對藜麥知之甚少，亟待將藜麥從田地推向餐桌。國內的藜麥產品多為初加工食品，主要是藜麥米，其他深加工產品較少，開發藜麥的深加工產品對藜麥產業發展具有重要意義。【前人研究進展】發酵食品是原料經微生物作用后獲得的產品，是人類日常飲食中的重要組成部分[6]。發酵可以改變食品材料的組織結構，形成獨特的風味；另外，通過降解抗營養物質和產生有益的成分來改善食品的營養特性[7]。藜麥高碳水化合物、高蛋白含量的特性可作為發酵原料，國外已有一些關于藜麥發酵產品的報道。CEBALLOS-GONZALEZ等[8]用乳酸菌發酵藜麥面團制成無谷蛋白白面包，獲得了均勻多孔、感官品質好、營養價值高的產品。LORUSSO等[9]用天然發酵藜麥粉代替小麥粉制備意大利面，可明顯改善其質地特性，增加蛋白質體外消化率和降低血糖生成指數。BIANCHI等[6]以藜麥和大豆為原料，以干酪乳桿菌為發酵劑，開發一種具有潛在益生菌功能的飲料。【本研究切入點】目前的研究較少探討關于發酵對藜麥主要營養成分的影響，尤其是脂質方面的研究幾乎沒有涉及。不同加工方式對藜麥營養代謝影響的相關報道較缺乏。【擬解決的關鍵問題】采用不同菌種發酵后，了解藜麥蛋白質水解情況并首次利用脂質組學技術對藜麥脂質進行分析，明確發酵后藜麥主要營養成分的變化趨勢，為藜麥發酵食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2019年3月在山西農業大學食品科學與工程學院進行。

1.1 材料與試劑

藜麥購于贛州市九鯉湖食品有限公司；活性干酵母、植物乳桿菌購于安琪酵母股份有限公司。

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨、異丙醇購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，色譜純；37種脂肪酸混合標準品、17種氨基酸混合標準品、色氨酸標品購于Sigma公司，分析純；牛肉膏、蛋白胨購于上海索萊寶生物科技有限公司；氫氧化鈉、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍、D-無水葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸等購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

SC-3610低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；YHG-400-BS-II遠紅外快速恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SH220F型石墨消解儀，山東海能科學儀器有限公司；安捷倫6560離子淌度Q-TOF LC/MS，安捷倫科技（中國）有限公司；ThermoFisher Trace 1310 ISQ氣相色譜質譜聯用儀、ThermoFisher U3000液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 酵母菌復壯：配置酵母菌培養基，于121℃滅菌20 min，待培養基冷卻后在無菌條件下接入酵母菌，在30℃的培養箱中靜置培養48 h，直至菌懸液濃度達到5×108CFU/mL。

植物乳桿菌復壯：配置植物乳桿菌培養基，于121℃滅菌 20 min，待冷卻后在無菌條件下接入植物乳桿菌，在37℃的培養箱中靜置培養48 h，直至菌懸液濃度達到5×108CFU/mL。

藜麥發酵粉的制備：藜麥經中草藥粉碎機粉碎后，過80目篩，制得藜麥粉（Q）。稱取50 g藜麥粉，共3份，加入50 mL無菌水，分別接入復壯的酵母菌（接種量4%）、植物乳桿菌（接種量4%）、酵母菌和植物乳桿菌混合菌（酵母4%+植物乳桿菌4%），在適宜條件（36℃）下培養48 h。發酵結束后，真空冷凍干燥即得酵母發酵藜麥粉（QY）、植物乳桿菌發酵藜麥粉（QL）和混合菌發酵藜麥粉（QM），保存于-20℃備用。

1.3.2 發酵藜麥蛋白水解特性的測定 蛋白質水解指數（PI）的測定[10]：PI=NPN/TN×100%，NPN（非蛋白氮）、TN（總氮）采用凱氏定氮法測定。

蛋白組分的測定[11]：分別稱取5 g藜麥粉和制備好的發酵藜麥樣品，用索氏抽提法脫脂后，采用Osborne分級法測定樣品的各蛋白組分，分別得到清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶性蛋白。

游離氨基酸的測定[12]：17種氨基酸分析方法：稱取0.5 g樣品，加入0.01 mol·L-1鹽酸40 mL，渦旋混勻5 min后超聲提取10 min，定容于50 mL容量瓶。避光靜置2 h后4 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加入1 mL 3%的磺基水楊酸，渦旋1 min，避光靜置1 h，15 000 r/min離心15 min，取上清液過膜待測。上機條件：Agilent C-18分析柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），流動相 A（0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液∶乙腈=93∶7），流動相 B（乙腈∶水=8∶2），流速為 1 mL·min-1，柱溫40℃，檢測波長254 nm，洗脫梯度為：0 min，0% B；14 min，15% B；29 min，34% B；30 min，100%B；37 min，100% B；38 min，0%B；45 min，0% B。色氨酸分析方法：用4 mol·L-1NaOH溶液充分溶解樣品，調pH至中性，過膜待測。色譜柱同上，流動相為0.02 mol·L-1醋酸溶液∶甲醇=8∶2，檢測波長為280 nm，柱溫25℃。

1.3.3 發酵藜麥脂質的測定 游離脂肪酸的測定[12]：稱取1 g樣品于試管中，加入2 mL 5%鹽酸甲醇溶液，3 mL氯仿甲醇溶液，100 μL十九烷酸甲酯內標，于85℃水浴1 h。待冷卻到室溫，加入1 mL正己烷，震蕩萃取2 min后，靜置1 h，待分層后取上層清液100 μL，用正己烷定容到1 mL，過膜后待測。分析條件：色譜柱為TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度290℃，載氣流速1.2 mL·min-1。升溫條件：80℃保持1 min，以10℃/min的速率升溫至200℃，再以 5℃/min的速率升溫至 250℃，最后以 2℃/min的速率升到270℃，保持3 min。質譜條件：離子源溫度 280℃，溶劑延遲時間 5 min，掃描范圍 30—400 amu，電離方式EI，電子能量70 eV。

脂質的測定[13]：稱取1 g樣品于玻璃試管中，加入10 mL溶液（二氯甲烷∶甲醇=2∶1），渦旋10 min，5 000 r/min離心10 min，萃取2次，合并兩次上清液。上清液中加入5 mL水，渦旋混勻1.5 min，5 000 r/min離心10 min，取下層氯仿層氮吹后用甲醇復溶，過膜待測。分析條件：色譜柱為Agilent Eclipse Plus C8（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：含 5 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸水溶液（A），乙腈∶異丙醇（5∶2，v/v）含5 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸（B）；流速為0.3 mL·min-1；梯度洗脫條件（0 min，60% B；11 min，100% B；20 min，100% B）；柱溫為40℃。離子源：AIS ESI；檢測模式為正離子模式；干燥氣流速為 15 L·min-1；干燥氣溫度200℃；霧化氣流速35 psi；鞘氣流速11 L·min-1；鞘氣溫度350℃；毛細管電壓3.5 kV；噴嘴電壓0 kV；掃描范圍：m/z 100—1 200；參比離子：121.0509、922.0098。

1.3.4 發酵藜麥淀粉含量的測定 采用DNS法[14]：根據葡萄糖反應后在540 nm處測定的吸光值，繪制的標準曲線為Y=1.058X-0.1269（R2=0.9986），X為葡萄糖濃度（mg·mL-1），Y為吸光度值。準確稱取1 g藜麥樣品，放入100 mL三角瓶中，加10 mL 6 mol·L-1HCL和15 mL蒸餾水，在沸水浴中加熱30 min，使其充分水解。待冷卻至室溫后調到中性，稀釋合適濃度進行測定。

1.4 數據處理

每個樣品進行3次平行試驗，結果表示為平均值±標準差。數據統計分析通過軟件IBM SPSS Statistics 22處理，多重比較采用LSD法，顯著水平為0.05；采用2010版Excel和Origin 9.0軟件繪制圖表。

2 結果

2.1 發酵對藜麥蛋白質水解的影響

2.1.1 對藜麥蛋白質水解指數的影響 如圖1所示，經酵母菌、植物乳桿菌和混合菌作用后，藜麥蛋白質的水解指數都顯著升高（P＜0.05），表明發酵后產生了更多的多肽、短肽及游離氨基酸等非蛋白氮，且不同菌的作用效果差異顯著。與 Q相比，QY、QL和QM的PI分別提高了18.7%、10.1%和17.3%，表明有酵母參與的發酵過程，更有利于藜麥蛋白向較小分子非蛋白氮的轉化。

圖1 發酵對藜麥蛋白質水解指數的影響Fig. 1 Effect of fermentation on protein hydrolysis index of quinoa

2.1.2 對藜麥各蛋白組分的影響 藜麥蛋白構成包括42.21%清蛋白、37.52%球蛋白、0.56%醇溶蛋白和7.22%谷蛋白，其中清蛋白和球蛋白是最主要的藜麥蛋白，約占總蛋白的80%，藜麥中的醇溶蛋白含量極低。經微生物作用后，各處理中的醇溶蛋白含量變化不顯著（P＞0.05），清蛋白、球蛋白和谷蛋白含量均顯著降低（P＜0.05），其中清蛋白和球蛋白變化更為明顯，說明微生物和蛋白酶主要分解作用這兩種蛋白。經酵母發酵后，QY的清蛋白和球蛋白含量較Q分別降低了10.43%和6.96%；植物乳桿菌作用后，QL的清蛋白和球蛋白含量較Q分別下降了5.10%和4.26%；混合菌發酵后，QM 的清蛋白和球蛋白的含量分別下降了7.68%和4.65%（圖2）。酵母菌發酵，更有利于藜麥蛋白分解成較小的分子，這與前面發酵對蛋白質水解指數影響的結果一致。

圖2 發酵對藜麥各蛋白組分含量的影響Fig. 2 Effect of fermentation on content of protein components in quinoa

2.1.3 對藜麥游離氨基酸含量的影響 發酵后藜麥游離氨基酸的變化情況如表1所示。藜麥富含所有的必需氨基酸且構成合理，其中亮氨酸、色氨酸和纈氨酸含量較高。藜麥中的含硫氨基酸含量較少，與前面測得的醇溶蛋白含量少相一致。經發酵后，必需和非必需游離氨基酸含量都顯著增加（P＜0.05），不同微生物作用效果差別明顯。酵母發酵后，游離的必需氨基酸約增加了15倍，游離的非必需氨基酸約增加了7倍，總游離氨基酸約增加了9倍；植物乳桿菌作用后，游離的必需氨基酸約增加了9倍，游離的非必需氨基酸約增加了3倍，總游離氨基酸約增加了5倍；混合菌發酵后，游離的必需氨基酸約增加了12倍，游離的非必需氨基酸約增加了6倍，總游離氨基酸約增加了8倍。藜麥發酵后，有更多的必需氨基酸得到釋放。經過酵母發酵，藜麥中的游離氨基酸含量顯著增加，尤其是必需氨基酸，進一步說明酵母發酵藜麥更有利于蛋白質水解成氨基酸。

2.2 發酵對藜麥脂類的影響

2.2.1 對藜麥游離脂肪酸含量的影響 經不同發酵處理后，藜麥中游離脂肪酸含量的變化情況如表2所示。藜麥中的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量分別是 5 588.22、13 433.32 和 30 705.28 mg·kg-1，且三者的比例約為1∶2.4∶5.5。在這些脂肪酸中，必需脂肪酸亞油酸含量最高，為26 213.13 mg·kg-1，此外，作為DHA和EPA前體的亞麻酸含量也較高，為4 353.54 mg·kg-1。通過發酵處理后，藜麥中游離的飽和、單不飽和和多不飽和脂肪酸含量都顯著增加（P＜0.05）。與藜麥原料相比，經酵母發酵后，飽和脂肪酸含量約增加了3.7倍，單不飽和脂肪酸含量約增加了2.4倍，多不飽和脂肪酸含量約增加了1.9倍，且3種脂肪酸的比例約為1∶1.7∶3.3；經植物乳桿菌發酵后，飽和脂肪酸含量約增加了 2.5倍，單不飽和脂肪酸含量約增加了1.8倍，多不飽和脂肪酸含量約增加了1.8倍，且3種脂肪酸的比例約為1∶1.9∶4.3；而經混合菌發酵后，飽和脂肪酸含量約增加了3.1倍，單不飽和脂肪酸含量約增加了2.3倍，多不飽和脂肪酸含量約增加了1.8倍，且3種脂肪酸的比例為1∶2∶3.8。

表1 發酵對藜麥游離氨基酸含量的影響Table 1 Effect of fermentation on free amino acids content of quinoa

2.2.2 對藜麥脂質的影響 在正離子模式下，通過IM-MS采集，與譜庫離子的一級、二級和碰撞橫截面積（CCS）信息比對共鑒定出176種脂質化合物，包括9種脂類，分別是97種甘油三酯（TG）、13種甘油二酯（DG）、28種卵磷脂（PC）、7種腦磷脂（PE）、13種溶血卵磷脂（LPC）、2種溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、6種磷脂酸（PA）、5種神經酰胺（Cer）和5種鞘磷脂（SM）。根據不同處理的藜麥樣品脂質構成繪制圖3。藜麥中的脂類最主要是TG（90.5%）和DG（5.5%），其他脂類含量不足5%（LPC（1.1%）、LPE（0.02%）、PA（1.0%）、PC（1.1%）、PE（0.6%）、SM 微量）。不同微生物發酵后會降低液質檢出藜麥總脂的含量，且各類脂的構成也發生了變化。經酵母發酵后，QY中TG和DG分別減少了3.7%和17.9%，其他功能脂除了 SM 都有所增加，脂類構成為：TG（90.1%）、DG（4.7%）、LPC（1.7%）、LPE（0.03%）、PA（1.1%）、PC（1.4%）、PE（0.7%）、Cer（0.2%）、SM微量。經植物乳桿菌發酵后，QL中TG和DG分別減少了0.9%和10.5%，除了未測到Cer，其他功能脂都有所增加，脂類具體構成為：TG（90.0%）、DG（5.0%）、LPC（1.6%）、LPE（0.03%）、PA（1.2%）、PC（1.3%）、PE（0.84%）和SM（0.03%）。經混合菌作用后，QM中TG和DG分別減少了3.6%和11.7%，

除了LPE變化不大，其他功能脂含量都有所增加，具體的脂類構成如下：TG（90.3%）、DG（5.1%）、LPC（1.2%）、LPE（0.02%）、PA（1.1%）、PC（1.2%）、PE（0.8%）、SM（0.04%）和Cer（0.2%）。有酵母菌參與的藜麥發酵能更有效降低TG含量，提高了其他功能脂的含量（DG除外）。

表2 發酵對藜麥游離脂肪酸含量的影響Table 2 Effect of fermentation on free fatty acids content of quinoa

圖3 發酵對藜麥脂質構成的影響Fig. 3 Effect of fermentation on lipid composition of quinoa

2.3 發酵對藜麥淀粉含量的影響

未處理的藜麥淀粉含量為 53.6%，經不同發酵處理后，藜麥淀粉含量均顯著降低（P＜0.05）。與 Q相比，QY淀粉含量降低了56.2%，QL淀粉含量降低了35.1%，QM淀粉含量降低了68.5%，酵母菌和植物乳桿菌生長代謝過程中都會大量消耗碳水化合物，且經混合菌發酵后，藜麥中淀粉含量下降最多（圖4）。可見，酵母較植物乳桿菌利用糖的效率更高。

3 討論

圖4 發酵對藜麥淀粉含量的影響Fig. 4 Effect of fermentation on starch content of quinoa

由于藜麥具有獨特的營養價值和潛在的健康益處，近年來備受關注[15]。藜麥富含大量營養素，平均蛋白質的質量分數約為16%，淀粉質量分數約為55%，脂類的質量分數約為 7%，這 3大營養成分約為藜麥總質量的78%。蛋白質和脂類相較于淀粉組成更為復雜，但酵對它們的影響在以往的研究中極少涉及。在發酵過程中，由于微生物或內源性蛋白酶的作用，將蛋白質水解為多肽、短肽及游離氨基酸等多種非蛋白氮形式[16]，從而會使衡量蛋白質水解程度的蛋白質水解指數（非蛋白氮占蛋白氮的百分含量）升高。利用清酒乳桿菌和木糖葡萄球菌在發酵成薩拉米香腸的過程中，45 d的發酵期后蛋白質水解指數增加了約15%[17]。在本研究中，酵母發酵后蛋白水解指數增加了 18.7%，混合菌提高了 17.3%，植物乳桿菌發酵后變化最小，為10.1%。酵母、植物乳桿菌發酵過程中，主要是清蛋白和球蛋白變化更為明顯，其中酵母對這兩種蛋白含量下降的影響更突出。王金水等[18]研究酵母和植物乳桿菌對小麥酸面團發酵過程中的蛋白質分解規律，發現酵母對面團中的蛋白質降解作用弱，而植物乳桿菌的降解效果顯著，且可溶蛋白和谷蛋白降解最為明顯。這個結果與本研究不完全一致，可能是由于小麥與藜麥的蛋白組成差異較大且發酵條件并不相同。已有研究表明，在僅有葡萄糖、果糖和乳糖作為碳源時，乳酸菌和酵母菌具有共生作用[19]，酵母菌產生了促進乳酸菌生長的生長因子，然而，這些生長因子的性質和功效取決于發酵微生物的種類和碳源等條件。從藜麥蛋白水解結果來看，混合菌發酵對蛋白的降解作用不如酵母單獨作用的效果好。在發酵過程中，谷物酶和微生物代謝對谷物蛋白質轉化都起到了重要作用[20]。蛋白質水解依賴于谷物蛋白酶，酵母、乳酸菌的肽酶活性決定了肽、氨基酸和氨基酸代謝物在面團或發酵制品中的積累[21]。然而已有研究表明，酸面團中肽含量較低，氨基酸含量較高，這是由于細胞內肽水解產生的多余氨基酸從細胞中釋放出來，肽的細胞內水解有助于氨基酸在酸面團中的積累[22]，這可能也是藜麥發酵后游離氨基酸含量增多的原因。此外，谷物中酚類化合物的種類和含量與酶促轉化和微生物代謝息息相關[23]，選擇對酚類具有抗性的微生物發酵至關重要。在谷物制品的發酵和焙烤過程中，微生物的蛋白質代謝除了具有水解產生氨基酸的作用外，還有助于風味的形成[24]。例如，鳥氨酸是小麥面包皮關鍵風味化合物 2-乙酰-1-吡咯啉在烘烤過程中形成的前體化合物，酵母或乳酸菌可以通過精氨酸代謝產生鳥氨酸[25]。本研究結果初步表明，酵母較植物乳桿菌發酵藜麥更有利于蛋白質、多肽等水解成氨基酸這些小分子化合物，有利于大分子的轉化。

相較于蛋白質和碳水化合物，脂類在藜麥中僅占少部分，但對發酵制品品質有重要影響，不僅能為人們的日常飲食提供必需脂肪酸，在加工貯藏中，脂類物質易發生氧化反應且是一些關鍵香氣化合物的前體物質[26]。脂質是一個具有高度多樣性的大家族，盡管傳統質譜法在脂質組學中具有高敏感和高選擇性，但由于脂類分子的結構多樣性且同分異構體的存在，很多脂類物質還是不能完全分離和準確鑒定[27]。離子淌度質譜（Ion Mobility-Mass Spectrometry，IM-MS）是離子淌度分離與質譜聯用的一種新型二維質譜分析技術。離子淌度分離原理是基于離子在漂移管中與緩沖氣體碰撞時的碰撞截面不同，離子可按大小和形狀進行分離，所得的漂移時間可進一步計算得到碰撞截面積（CCS）[28]。脂質離子的CCS值代表其與緩沖氣體之間可以發生碰撞的有效面積，該值與脂質離子自身的大小、形狀及其所帶電荷有關，是脂質離子固有的物理化學特性，在鑒定中引入CCS值可以極大地提高可信度[29]。本研究中，通過離子碎片的一級、二級和CCS的信息與譜庫進行匹配共鑒定出176種脂質化合物，包括9個種類。小麥粉發酵后，糖脂含量會降低，而非極性脂和磷脂含量會增加，JANSSEN等[30]認為是由于發酵前后蛋白質與不同種類脂的結合而造成。EI-SEBAIY等[31]研究發酵鯔魚的脂質變化，發現發酵結束后，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比值有所升高，這與本研究的結果一致，且飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的比值更接近1∶1∶1（FAO/WHO推薦的脂肪酸平衡飲食）。VISESSANGUAN等[32]研究了發酵對泰式香腸Nham脂質及脂肪酸的影響，結果與本研究相似，隨著游離脂肪酸的增加，甘油三酯、甘油二酯含量會有所下降。加工對脂質構成的影響在動物性食品中研究較多，在谷物類食品中相對較少涉及。本研究發現通過發酵可以改變藜麥的脂質組成，甘油三酯含量相對降低，LPC、LPE、PA、PC和PE相對含量都有所增加，微生物發酵可使藜麥的脂質組成更為合理。

發酵會改善淀粉類食品的營養組成和口感。淀粉作為藜麥含量最多的成分，也是微生物消耗的碳源，發酵后，藜麥中的淀粉含量顯著降低。在植物乳桿菌發酵秈米粉過程中，總淀粉含量降低的同時，直鏈淀粉在總淀粉中的比例會增大。推測可能是植物乳桿菌產生的異淀粉酶將支鏈淀粉轉化為直鏈淀粉[33]。NUMFOR等[34]對發酵木薯粉的淀粉進行了研究，也發現直鏈淀粉含量顯著增加。本研究只測定了發酵對藜麥淀粉含量的影響，而未對淀粉的理化特性進行分析，然而淀粉的特性對谷物食品的加工適性有重要影響，下一步可針對這部分內容開展深入研究。

4 結論

不同菌種發酵均會增加藜麥蛋白質水解指數，且主要作用于清蛋白和球蛋白。有酵母參與的發酵，更有利于藜麥蛋白向較小分子非蛋白氮的轉化。不同發酵都會顯著提高游離脂肪酸的含量，且脂類的構成也會發生變化，降低甘油三酯、甘油二酯含量，磷脂等功能脂含量增加，酵母菌發酵更有利于這種轉化。因此，酵母較植物乳桿菌更有利于改善發酵藜麥的營養，研究結果為藜麥發酵制品的開發提供了理論依據。