大豆異黃酮對早期斷奶仔豬生長性能、抗氧化功能及腸粘膜形態結構的影響

林廈菁, 陳芳, 蔣守群, 蔣宗勇

（廣東省農業科學院動物科學研究所/畜禽育種國家重點實驗室/農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室/廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

【研究意義】仔豬在正常生理狀態下，體內活性氧的產生與清除處于動態平衡，當體內自由基穩衡態異常，自由基產生增多，機體清除自由基損傷的能力降低，使體內自由基進一步蓄積，導致生長抑制并可誘發疾病或者死亡[1]。目前集約化養豬生產中普遍采用的早期斷奶技術易引起斷奶仔豬產生氧化應激[2]，而仔豬的生長性能和存活率是影響豬場經濟效益的重要因素，如何降低仔豬斷奶應激是提高養豬生產效率的關鍵?！厩叭搜芯窟M展】機體氧化應激會導致斷奶仔豬肝臟抗氧化酶活性的降低和抑制羥自由基能力，降低空腸絨毛高度、增加隱窩深度，提高脾臟 MDA水平、減少淋巴細胞數量，影響養分的吸收與利用，降低機體免疫能力[3-4]。大豆異黃酮是存在于大豆中具有多酚結構的化合物，以3-苯并吡喃酮為基本母核，由于其側鏈上具有活性羥基，能夠有效清除自由基，抗氧化效果顯著[5-6]。大豆異黃酮具有調控動物機體養分代謝，增強免疫力和提高生產性能等作用[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c】目前大豆異黃酮在豬上的研究關注點主要集中在生長性能、機體抗氧化方面，而大豆異黃酮對早期斷奶仔豬腸道抗氧化作用的報道較少?！緮M解決的關鍵問題】本試驗通過在飼糧中添加不同水平大豆異黃酮，探討其對早期斷奶仔豬機體與腸道抗氧化性能的影響，為大豆異黃酮在早期斷奶仔豬生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

大豆異黃酮由廣東省農業科學院動物科學研究所研制開發，純度為 98.5%。大豆濃縮蛋白購于廣州菲傲生物科技有限公司，乳清粉購于 Glanbia公司，白魚粉購于CFG公司。

1.2 試驗動物分組與設計

試驗選用160只胎次相近、體況良好的21日齡斷奶的杜×（大×長）三元雜交仔豬（平均重為5.5 kg），采用單因子隨機區組設計，根據體重和性別隨機分成5個處理，每個處理4個重復，每重復8頭仔豬（公母各半）。各處理組飼糧中分別添加 0（對照組）、10、20、40和80 mg·kg-1異黃酮。試驗豬在同一豬舍內飼養，各處理組的飼養管理和環境條件一致。試驗期為42d，試豬自由采食、飲水，飼料少量多次投喂，保持飼料的新鮮。飼養試驗于2017年在廣東省農業科學院動物科學研究所試驗基地進行。

1.3 試驗飼糧

試驗基礎飼糧營養水平參考NRC（1998）和中國《豬飼養標準》（2004版）仔豬的飼養標準。基礎飼糧組成和營養水平見表1。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能 試驗開始、斷奶7d及結束時，仔豬空腹16h稱個體重，統計每重復耗料量，計算試驗7及 42d仔豬平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

1.4.2 抗氧化指標測定和方法 試驗7d及結束時每重復選取體重接近的試驗豬2只（公母各1只），前腔靜脈采血，分離血清，分裝于Ep管中，-20℃凍存；采血后屠宰取肝臟組織和空腸上段組織，-20℃凍存；使用南京建成生物工程有限公司試劑盒測定血清、肝臟和腸道組織超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性以及丙二醛（MDA）含量，肝臟組織金屬硫蛋白（MT）含量采用鎘飽和法測定[10]。

1.4.3 十二指腸粘膜形態結構電鏡觀察 試驗豬屠宰后，小心截取十二指腸中段約1 cm，用冰冷的生理鹽水沖洗干凈，剪成長寬約為3 mm的正方形小塊，以戊二醛溶液固定24 h后，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.35）漂洗3次，每次15min，然后用1%鋨酸固定1 h，再次用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗，用酒精梯度脫水（50%-70%-80%-90%-100%）兩次。第二次脫水后加入無水硫酸銅。再用醋酸異戊酯過渡2次，每次15min，臨界點干燥。裝臺，粘樣，IB.5噴金，用電鏡（XL30ESEM，日立，日本）掃描、拍照觀察十二指腸粘膜形態結構。

表1 基礎飼糧組成和營養水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (as fed basis)

1.4.4 十二指腸粘膜形態結構光鏡觀察 試驗豬屠宰后，小心截取十二指腸中段約1 cm，用冰冷的生理鹽水沖洗干凈，經甲醛固定、修整、水洗、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片，蘇木素、伊紅染色后，光鏡（Nikon Eclipse E100，尼康公司，日本）拍照測量絨毛長度和隱窩深度，詳細方法參照文獻[11]。

1.4.5 外周血液 T淋巴細胞亞群參數及淋巴細胞轉化率 試驗豬前腔靜脈采血，使用武漢博士德生物工程公司提供的即用型SABC免疫化染色試劑盒及方法（AEC顯色試劑盒染色）測定血液中 T淋巴細胞CD4+、CD8+亞群比例，采用MTT法[12]測定淋巴細胞轉化率（CX5型，Beckman儀器公司，美國）。

1.5 統計分析

所有數據采用SAS軟件GLM進行統計分析，差異顯著者進行DUNCAN多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，其中差異顯著的指標再進行回歸分析，得出回歸方程，其中y為檢測指標，x為大豆異黃酮添加水平。本試驗中所有數據表示方式為：平均值±標準誤（Means±S.E.）。

2 結果

2.1 大豆異黃酮對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可見，添加大豆異黃酮未顯著影響仔豬平均日增重（P＞0.05），整個試驗階段添加大豆異黃酮40 mg·kg-1組平均日增重高于其它各組（15.45 %—32.59 %）；斷奶后8—42 d和整個試驗期階段，大豆異黃酮40 mg·kg-1組試豬平均日采食量顯著高于空白對照組、10 mg·kg-1大豆異黃酮組和 20 mg·kg-1大豆異黃酮組（P＜0.05），8—42 d 平均日采食量回歸方程為：y= -0.1x2+1.57x+340.08（R2 = 0.410P=0.590）；0—42 d平均日采食量回歸方程為：y= -0.008x2+1.235x+ 312.79（R2 = 0.393P=0.607）。斷奶后 8—42 d時，20 mg·kg-1大豆異黃酮組試驗豬料重比顯著低于空白對照組和80 mg·kg-1大豆異黃酮組（P＜0.05），回歸方程為：y= 0.0001x2- 0.007x+ 1.684（R2 = 0.392P=0.608）。

2.2 大豆異黃酮對斷奶仔豬血清及肝臟組織抗氧化性能的影響

由表3可見，添加大豆異黃酮對斷奶7天仔豬血清MDA含量無顯著影響（P＞0.05）。肝臟中MDA含量隨大豆異黃酮添加水平提高有降低的趨勢，其中添加大豆異黃酮40和80 mg·kg-1組試驗豬肝臟中的MDA含量顯著低于空白對照組和10 mg·kg-1大豆異黃酮組，回歸方程為：y= 0.001x2- 0.255x+ 31.32（R2= 0.955P=0.027），得到大豆異黃酮最適宜添加量為127.5mg·kg-1。添加大豆異黃酮 20mg·kg-1組仔豬血清SOD活性顯著高于空白對照組、40mg·kg-1大豆異黃酮組和 80mg·kg-1大豆異黃酮組（P＜0.05），回歸方程為：y= -0.005x2+ 0.119x+ 61.47（R2 = 0.665P=0.335）。飼糧中添加大豆異黃酮對仔豬血清GSH-Px 活性、肝臟中的SOD活性和MT含量無顯著影響（P＞0.05）。添加大豆異黃酮10 mg·kg-1組肝臟組織GSH-Px 活性顯著高于對照組和 80 mg·kg-1大豆異黃酮組（P＜0.05），回歸方程為：y= -0.002x2+ 0.051x+ 65.14（R2= 0.493P=0.507）。

表2 大豆異黃酮對斷奶仔豬生長性能的影響Table 2 Effects of dietary soy isoflavone supplementation on growth performance of early-weaned piglets

由表 4看出，添加大豆異黃酮添加對斷奶 42d仔豬血清和肝臟組織的MDA含量沒有顯著影響（P＞0.05），其中添加大豆異黃酮 20mg·kg-1組肝臟組織中MDA含量較空白對照組降低38.98%。添加大豆異黃酮 40mg·kg-1組血清 SOD活性顯著高于空白對照組、10 mg·kg-1大豆異黃酮組和 80mg·kg-1大豆異黃酮組（P＜0.05），回歸方程為：y= -0.012x2+0.91x+ 69.42（R2 = 0.964P=0.027），得到大豆異黃酮最適宜添加量為 37.92 mg·kg-1。添加大豆異黃酮 20 mg·kg-1組肝臟的GSH-Px活性顯著高于空白對照組和80 mg·kg-1大豆異黃酮組（P＜0.05），回歸方程為：y= -0.006x2+0.415x+ 62.53（R2 = 0.669P=0.331）。添加大豆異黃酮對斷奶42d仔豬肝臟的MT含量沒有顯著影響（P＞0.05）。

表3 大豆異黃酮對仔豬斷奶后7d血清和肝臟抗氧化指標的影響Table 3 Effects of dietary soy isoflavone supplementation on antioxidative indices of early-weaned piglets on day 7 after weaning

表4 大豆異黃酮對仔豬斷奶后42d血清和肝臟抗氧化指標的影響Table 4 Effects of soy isoflavone on antioxidation parameters of weaned piglets on day 42 after weaning

2.3 大豆異黃酮對斷奶仔豬空腸抗氧化性能的影響

由表5可知，在斷奶后7d，飼糧添加大豆異黃酮對斷奶仔豬空腸MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性，MT含量無顯著影響（P＞0.05）。斷奶后42d，添加大豆異黃酮40和80mg·kg-1組的空腸SOD活性顯著高于對照組（P＜0.05），回歸方程為：y= -0.005x2+0.484x+ 40.66（R2 = 0.860P=0.140）。添加大豆異黃酮40mg·kg-1組空腸的GSH-Px活性顯著高于對照組和10mg·kg-1大豆異黃酮組（P＜0.05），回歸方程為：y= -0.007x2+0.635x+ 19.27（R2 = 0.863P=0.137）。飼糧大豆異黃酮對空腸的MT含量有顯著影響作用，其中添加大豆異黃酮10mg·kg-1組空腸的MT含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），回歸方程為：y= -0.002x2+0.139x+ 11.16（R2 = 0.250P=0.750）。

表5 大豆異黃酮對斷奶仔豬小腸抗氧化指標變化的影響Table 5 Effects of soy isoflavone on small intestinal antioxidation indices of weaned piglets

2.4 大豆異黃酮對斷奶仔豬十二指腸絨毛形態結構的影響

由圖1可以看出，斷奶后7、42d對照組仔豬十二指腸絨毛成舌狀排列，絨毛頂端凹陷且脫落嚴重，各處理組與對照組相比，十二指腸絨毛損傷程度降低，其中添加大豆異黃酮 40mg·kg-1組仔豬十二指腸絨毛最完整，成柱狀排列。

2.5 大豆異黃酮對斷奶仔豬免疫指標的影響

由表6可見，添加大豆異黃酮對斷奶仔豬7d血液中淋巴細胞轉化率、CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+無顯著影響（P＞0.05）。添加大豆異黃酮對斷奶仔豬42d的血液中CD4+的水平有顯著影響作用，對淋巴細胞轉化率、CD8+、CD4+/ CD8+無顯著影響（P＞0.05），其中添加大豆異黃酮10、20 mg·kg-1組血液中CD4+水平顯著低于空白對照組和 80mg·kg-1大豆異黃酮組（P＜0.05），回歸方程為：y= 0.002x2-0.128x+ 31.42（R2 =0.288P=0.712）。

3 討論

3.1 大豆異黃酮對斷奶仔豬生長性能的影響

大豆異黃酮能與下丘腦、垂體中的雌二醇受體進行不同水平的結合，從而影響動物神經內分泌系統促進垂體生長激素的生成和釋放以及刺激胰島素樣生長因子-1的增加[13-14]。也有研究表明，大豆異黃酮能夠通過促進轉錄活性增加組織的蛋白質合成水平[15]；在體外培養試驗中發現大豆異黃酮能夠促進離體小腸對葡萄糖的吸收和利用[16]；大豆異黃酮還能夠促進甲狀腺分泌，使血中三碘甲狀素原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）水平明顯升高，提高機體對營養物質的代謝和利用[17-18]。以上研究說明大豆異黃酮對于機體的生長性能具有促進作用。本試驗結果顯示，添加大豆異黃酮能夠顯著的提高斷奶仔豬的采食量和飼料轉化率，尤其是試驗后期斷奶7—42d的作用更加明顯，說明大豆異黃酮調節動物機體的作用需要一定的時間，結合本試驗腸道絨毛電鏡的結果認為大豆異黃酮很有可能是通過保護腸道屏障的完整，促進營養物質的消化吸收而提高斷奶仔豬的采食量和飼料轉化率。CREINER等[19]分別在斷奶仔豬飼糧中添加三羥基異黃酮和二羥基異黃酮（0、200、400、800 mg·kg-1），研究其對豬生長和病毒感染的影響，結果表明三羥基異黃酮與二羥基異黃酮都能減少病毒的復制，提高仔豬增重和飼料利用率。郭慧君等[20]給斷奶去勢仔豬飼喂5mg·kg-1大豆異黃酮，仔豬體重較空白對照組增加3.7%，飼料轉化率提高33.81%。程忠剛等[21]報道仔豬日糧中添加20mg·kg-1大豆黃酮可以提高仔豬日增重，降低料重比。這些試驗結果與本試驗的相一致。綜合分析本試驗各階段測定結果，認為斷奶仔豬飼糧中添加40mg·kg-1大豆異黃酮最適宜。

表6 大豆異黃酮對斷奶仔豬免疫指標的影響Table 6 Effects of soy isoflavone on immunity index in weaned piglets

3.2 大豆異黃酮對斷奶仔豬抗氧化性能的影響

斷奶后營養源由母乳改為固體飼料，但是仔豬消化系統和免疫系統均發育不完善，易引起仔豬消化能力和抗逆能力差，再加之與母豬分離，諸多因素引起仔豬產生氧化應激[22]。組織和血清中MDA的含量增高反映了機體內脂質過氧化程度的增大，間接反映細胞受損的程度[23]。SOD是組織細胞內自由基清除體系中最重要的物質, SOD的活性反映了細胞內清除自由基即抗氧化的能力[24]。GSH-Px活性對于清除體內多余的自由基，恢復機體正常細胞代謝也同樣具有重要作用[25]。本試驗的研究結果顯示，斷奶仔豬飼糧中添加大豆異黃酮可以顯著的降低肝臟中MDA含量，并且隨著添加劑量的提高MDA含量水平逐漸降低。低水平（10—40 mg·kg-1）大豆異黃酮提高機體組織中SOD和GSH-Px活性，高水平（80 mg·kg-1）反而降低組織中SOD和GSH-Px活性，試驗結果說明大豆異黃酮確實對緩解斷奶仔豬應激有顯著的作用，但是高水平的大豆異黃酮對機體抗氧化作用有負面影響，這個結果與腸道的電鏡結果相呼應，高水平的大豆異黃酮會引起小腸絨毛的損傷，造成的原因需要進一步的研究。金屬硫蛋白（MT）是與金屬離子具有高度親和性的低分子含量蛋白，具有解毒和調節體積抗氧化功能[26]。本試驗數據顯示，添加低水平的大豆異黃酮可以顯著提高機體MT的含量，高水平大豆異黃酮反而沒有明顯提高作用，該結果與抗氧化酶（SOD、GDH-Px）結果一致。斷奶后，腸道內環境發生各種變化：微生物、固體飼糧的刺激，使小腸吸收過程中產生大量的自由基破壞腸道細胞膜的完整性，致使腸絨毛萎縮破裂脫落，隱窩深度增大，吸收細胞減少而分泌細胞增多、營養吸收能力降低，腸道修復功能減弱，合成抗氧化酶能力減弱等[27-28]。本試驗研究發現，斷奶后7—42d，空白對照組試驗豬十二指腸絨毛頂端凹陷萎縮、成舌葉狀且出現破裂脫落，腸絨毛密度降低，而飼糧中添加 10—40mg·kg-1大豆異黃酮可以使十二指腸絨毛損傷得到緩解，呈手指狀；同時可降低空腸組織 MDA含量，提高SOD、GSH-Px活性和MT含量。綜合抗氧化生化檢測結果和腸道絨毛電鏡結果認為斷奶仔豬飼糧中添加大豆異黃酮可以在機體發揮清除自由基的作用，同時增強抗氧化酶的活性、提高抗氧化蛋白MT的含量，保護腸道屏障不受到損傷，其中40 mg·kg-1大豆異黃酮的添加效果最好。

3.3 大豆異黃酮對斷奶仔豬機體免疫性能的影響

根據T淋巴細胞表型和功能的不同可分為不同的亞群，只有表達CD4+和CD8+分子才表明T淋巴細胞進入成熟階段，檢測CD4+和CD8+淋巴細胞的百分率及二者的比值是評估機體的免疫狀態的重要指標[29]。淋巴細胞轉化率也是測定機體細胞免疫功能的主要方法之一[30]。本試驗結果顯示，添加大豆異黃酮對于淋巴細胞轉化率、CD8+和CD4+和CD8+兩者的比值沒有顯著的作用，還會降低血液中的CD4+含量。林映才等[31]報道大豆異黃酮提高了生長豬血液中T淋巴細胞CD4+/CD8+比值。張響英等[32]對公仔豬注射乳化后的大豆黃酮，結果胸腺、脾臟重量均有增加趨勢。張湯杰等[33]試驗顯示，注射大豆黃酮可使公仔豬淋巴細胞增殖反應下降，機體的細胞免疫能力下降；而對母仔豬無影響，其認為植物雌激素對仔豬免疫功能的影響有性別上的差異。有研究報道大豆異黃酮提高動物免疫的機制主要可能是直接作用于免疫器官或者是免疫細胞上的雌激素受體，調節垂體生長激素或者催乳素的分泌從而間接促進免疫功能[34]。本試驗設計為公母混養，可能由于機體雌激素水平不同，導致大豆異黃酮對機體的免疫性能作用不顯著，具體原因有待進一步的分析研究。

3.4 大豆異黃酮在斷奶仔豬飼糧中的適宜添加量

添加大豆異黃酮對斷奶仔豬的平均日采食量、料重比和抗氧化生化指標有顯著影響，通過回歸分析得出回歸方程式，其中只有斷奶7d仔豬的血清MDA含量和42d血清中SOD活性這兩個指標能夠擬合出可信度比較高（R2＞0.9，P＜0.05）的方程，并得出最適宜添加量分別是127.5和39.72 mg·kg-1。結合本試驗設計的添加水平和具體的試驗結果，我們認為斷奶仔豬大豆異黃酮最適宜添加量為40mg·kg-1。

4 結論

飼糧中添加大豆異黃酮可提高斷奶仔豬的生長性能，增強血清、肝臟和腸道抗氧化水平，對腸道屏障有一定的保護作用。斷奶仔豬大豆異黃酮適宜添加量為 40 mg·kg-1。