混菌靜態發酵改善雙低菜籽粕品質

郝怡寧，王志高，何榮，鞠興榮，袁建

（南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心/江蘇省糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023）

0 引言

【研究意義】菜籽粕（rapeseed meal，RSM）作為菜籽油的副產物，年產量超過4 000萬t，在蛋白質餅粕的產量中僅次于豆粕（Soybean meal，SBM），排名第二位[1]。我國是農業大國，油菜籽的產量居世界第一，菜籽粕的年產量已超過1 000萬t[2]。菜籽粕是一種重要的蛋白質資源，由于其富含粗蛋白、蛋氨酸、賴氨酸等營養成分，具有很高的潛在營養價值，所以其發展潛力巨大。但是菜籽粕中存在一些抗營養因子，如硫代葡萄糖苷、粗纖維、植酸等，特別是高水平的硫代葡萄糖苷，會降低適口性，導致生長遲緩、甲狀腺腫大和器官組織受損[3]；此外，這些抗營養因子可以使消化酶失活，降低高活性肽的釋放速率，從而降低營養利用率。因此，過去的很多研究都側重于去除抗營養因子，而忽略了營養因子的增加[4-5]。隨著雙低菜籽粕的出現，提高菜籽粕的綜合品質，改善菜籽粕的營養結構就顯得尤為重要。揮發性風味物質及呈味物質組成是評價農產品特別是飼用經濟作物品質的重要指標之一。采用電子鼻和電子舌快速檢測菜籽粕發酵過程中風味變化的綜合信息，對提高菜籽粕品質具有重要的意義。在目前我國蛋白資源緊缺的情況下，改善菜籽粕品質，提高菜籽粕的利用率，可推動我國畜牧和食品工業的發展，并帶來顯著的經濟和社會效益。【前人研究進展】為了降低成本，緩解資源短缺的現狀，許多研究人員一直在急于尋找其他的蛋白來源來降低豆粕的使用[6]。酶解法已經被用來提高菜籽粕的營養價值，主要是增加小肽含量，但是酶解效率低，并且成本較高。微生物發酵被認為是一種去除抗營養因子，同時提高營養價值的替代方案。前人的研究表明，微生物發酵可以增加菜籽粕中小肽含量[7]，提高適口性，從而提高營養利用率，但不同菌種的發酵效果不同。顧斌等[8]研究發現，枯草芽孢桿菌和白地霉混菌發酵可以提高菜籽粕中蛋白的效價，降低抗營養物質。小鼠試驗表明，在飼糧中添加一定比例的發酵菜籽粕雖然能夠促進小鼠生長，但是長期食用會對小鼠的肝臟和腎臟造成輕度損傷。WANG等[2]利用乳酸菌發酵菜籽粕產生乳酸促進酸味，通過蛋白質變性來降低咀嚼性，從而提高適口性，增加消費者的接受度。【本研究切入點】過去為了提高菜籽粕的利用率，微生物發酵的研究多集中于菜籽粕脫毒上，而忽略了提高和改善菜籽粕的綜合品質，造成了資源浪費。氣味和滋味是評價發酵菜籽粕綜合品質的重要指標之一，但微生物發酵對菜籽粕風味物質及呈味物質影響的研究未見報道。通過靜態發酵代替攪拌式發酵，降低大規模發酵的生產成本。【擬解決的關鍵問題】采用混菌靜態發酵工藝，在降低抗營養物質的基礎上豐富菜籽粕的營養價值，改善菜籽粕的營養結構。利用電子鼻和電子舌等綜合分析技術，研究發酵前后以及發酵過程中菜籽粕氣味與滋味的變化，并通過體內試驗驗證發酵菜籽粕的生物可利用性，全面探討靜態發酵工藝對菜籽粕品質特性的影響，為菜籽粕的廣泛利用和深度開發提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于 2018年在南京財經大學食品科學與工程學院國家重點實驗室進行。動物試驗于2019年1月在南京申基生物有限公司進行。

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis20030、雅致放射毛霉Actinomucor elegans40252，中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.1 主要原料 甘藍型雙低菜籽粕，粉碎后過 60目篩備用。

1.1.2 主要試劑 細胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、還原型谷胱甘肽、甘氨酸、甲醇（色譜純）、川芎嗪標品，上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；高速冷凍離心機，Thermo Fisher公司；恒溫培養震蕩器，上海智城分析儀制造有限公司；味覺分析儀--ASTREE電子舌、α-FOX3000電子鼻，法國 Alpha MOS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 靜態發酵 發酵之前混合物組成為：190 g菜籽粕和10 g麥麩混合，加入270 mL蒸餾水（包含0.5%的葡萄糖和0.36% KH2PO4）。將混合物在120℃條件下滅菌20 min，在超凈臺內冷卻后接種枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉，接種比例為4∶1，攪拌均勻后在32℃下靜置5 d，每隔1 d取樣。取出菜籽粕樣品在50℃下烘干，時間為36 h。將烘干后的菜籽粕磨成粉，過60目篩，保存在4℃條件下備用。

1.3.2 菜籽粕（抗）營養物質的測定 硫甙：氯化鈀法[9]；粗纖維：酸堿消煮法，GB/T6434—2006；植酸：三氯化鐵比色法[10]；粗蛋白、水溶性蛋白：NYT 1205—2006；多肽：參考魯偉等[11]的方法。

1.3.3 氨基酸的測定 準確稱取一定量樣品于水解管中，在減壓條件下加6 mol·L-1鹽酸，密封后在110℃高溫下水解24 h，將水解液過濾后旋蒸除去鹽酸至干，用 0.02 mol·L-1的鹽酸定容至 50 mL，稀釋兩倍后經0.22 μm濾膜過濾，上氨基酸自動分析儀檢測。

1.3.4 多肽分子量分布的測定 TSKgel G2000SWXL色譜條件參考谷中華等[12]的方法。分子量標品為細胞色素C（MW 12327 D）、抑肽酶（MW 6511.51 D）、桿菌肽（MW 1422.69 D）、還原型谷胱甘肽（MW 307.32 D）、甘氨酸（MW 75.067 D）

1.3.5 川芎嗪的檢測

1.3.5.1 色譜條件 參考蘭順[13]的方法，并稍作修改。色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇：超純水（50∶50 V/V）；流速：0.7 mL·min-1，檢測波長：282 nm；柱溫：室溫。

1.3.5.2 制備標準曲線 精確稱取 TTMP標品于適當體積的甲醇中，制備濃度為20 μg·mL-1的母液。取標準品母液稀釋，用0.45 μm微孔濾膜過濾，分別制成濃度為 1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 和 16.0 μg·mL-1的溶液。

1.3.5.3 樣品溶液的配制 以甲醇為溶劑，料液比1∶40，超聲提取30 min，4 500 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得樣品溶液。

1.3.6 電子鼻感官評價 精確稱取 2.00 g菜籽粕樣品放置于20 mL頂空瓶內，樣品測量流速為150 mL·min-1，檢測時間為120 s。該電子鼻裝有12個不同的氣體傳感器：LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2和PA/2，通過傳感器陣列響應和模式識別技術對揮發性氣體分子進行分析。

1.3.7 電子舌感官評價 準確取2.00 g待測樣品，加入蒸餾水后搖勻，定容后倒入測量杯進行檢測。本試驗所用的Astree電子舌系統配置了AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、ANS和SCS 7根傳感器，其中AHS、CTS、NMS、ANS和SCS為5根專一性傳感器，分別對酸、咸、鮮、甜和苦具有專一響應。測定時每個樣品的數據采集時間為120 s，記錄第120 s時傳感器的響應值，用于后續分析。

1.3.8 動物試驗 按體重將 Spargue-Dawlcy大鼠分為空白豆粕組（SBM組）和試驗菜籽粕組（FRSM組，發酵菜籽粕等氮代替基礎飼糧25%的豆粕），每組6只，兩組大鼠初始平均體重分別為53.9和54.6 g。試驗周期為42 d，每隔7 d稱重測定平均日增重和平均日采食量。參考湯震等[14]的方法，取腎臟、肝臟胸腺和脾臟，對胸腺和脾臟分別稱重，測定大鼠免疫器官指數。對大鼠腎臟、肝臟和胸腺進行病理切片，HE染色后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數據處理

每組試驗重復3次，所得結果以平均值形式表示。采用Origin 8.5繪圖，應用SPSS統計軟件分析試驗數據，采用單因素方差分析評價兩組間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結果

2.1 混菌靜態發酵對雙低菜籽粕營養成分的影響

2.1.1 對硫甙葡萄糖苷、粗纖維、植酸與蛋白的影響 由圖1-A可知，隨著發酵時間的延長，硫甙葡萄糖苷、粗纖維和植酸的含量逐漸降低。硫代葡萄糖苷的含量由 20.37 μmol·g-1降至 11.15 μmol·g-1，降解率達 45.26%。粗纖維和植酸的降解率分別為31.16%和41.37%。由圖1-B可知，粗蛋白、水溶性蛋白和多肽的含量均在發酵后期有顯著增長。發酵后菜籽粕中水溶性蛋白的含量由 10.3%顯著增加到20.26%，多肽含量由2.7%增加到10.3%，增加率高達281.48%。

圖1 靜態發酵對菜籽粕中抗營養物質（A）和營養物質（B）的影響Fig. 1 Effect of static fermentation on antinutrients (A) and nutrients (B) in rapeseed meal

2.1.2 對多肽分子量分布的影響 如圖2所示，未發酵菜籽粕中主要含有高分子量的蛋白質，經過微生物發酵，蛋白質被水解成氨基酸和分子量在180—7 000 Da的多肽。發酵第3天，1 586 Da之前的峰值已經不存在，當發酵第5天時，大部分菜籽多肽被降解為分子量在500—108 Da的小分子肽。

2.1.3 對氨基酸組成的影響 發酵前后氨基酸總量和組成發生了顯著性變化（表 1），但發酵第 3天與發酵第5天的菜籽粕氨基酸總量無明顯變化。發酵5 d后，菜籽粕中氨基酸總量增加了19.58%，必須氨基酸總量增加了25.30%。半胱氨酸和苯丙氨酸的增幅較大，分別為96.88%和74.55%，賴氨酸、蘇氨酸、精氨酸的增幅較低，分別為13.25%、14.39%和7.78%。

2.1.4 對川芎嗪含量的影響 由圖3可知，在菜籽粕中并未發現川芎嗪，發酵1 d后川芎嗪以一種新的物質出現，并隨著發酵時間的延長，川芎嗪的含量迅速增加，在發酵第5天達到590 mg·kg-1。

2.2 混菌靜態發酵對雙低菜籽氣味的影響

由于揮發性化合物的任何輕微變化都會引起電子鼻傳感器響應的差異[15]，因此，電子鼻技術已被廣泛應用于食品研究[16]。在本研究中，利用配備 12個傳感器的電子鼻獲得菜籽粕的綜合風味圖譜。每個傳感器的響應幅度取決于氣味分子的組成和濃度[15]。用電子鼻分析菜籽粕和發酵1、3、5 d后的菜籽粕樣品，由圖4可知，4個樣品的指紋圖譜均存在顯著差異。圖 4-A 顯示，傳感器ly2/lg、pa/2、t70/2、p40/1、p10/2、p10/1、t30/1對4個樣品的響應值均大于零，并且隨著發酵時間的延長而增加。相反，除了傳感器LY2/gCT外，其他傳感器（LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL）的響應是負的，并且隨著發酵時間的增加而降低。結果表明，生RSM和5 d樣品的揮發性成分在發酵過程中差異最大。這些差異可能是由于一些揮發性化合物的出現或消失以及相似揮發性化合物濃度的變化所造成[17]。雷達指紋圖譜顯示，發酵3 d和5 d后的菜籽粕香氣分布比其他分布更接近，說明它們的氣味相似性很高。

圖2 菜籽粕發酵過程中菜籽肽分子量分布Fig. 2 Molecular weight distribution of peptides in rapeseed meal during fermentation

表1 發酵菜籽粕中氨基酸的種類和含量Table 1 Types and contents of amino acids in rapeseed meal and fermented rapeseed meal

圖3 菜籽粕粕中川芎嗪的色譜圖（A）、川芎嗪在發酵過程中含量的變化（B）Fig. 3 Chromatographic charts of tetramethylpyrazine in rapeseed meal (A), changes of tetramethylpyrazine content during fermentation (B)

圖4 不同發酵時間菜籽粕樣品的電子鼻的雷達圖（A）和PCA圖（B）Fig. 4 Radar fingerprint chart (A) and PCA (B) of electronic nose data for rapeseed meal at different fermentation times

圖4-B顯示菜籽粕和發酵菜籽粕的主要成分1和2的貢獻率分別為96.51%和3.128%。總方差貢獻率為99.638%（95%以上），表明該方法有效，反映了樣品提供的總體信息，因此在一定意義上可以代表樣品揮發性風味物質的主要特征[18]。PCA結果表明，RSM的揮發性化合物位于第一象限，但其他發酵樣品位于不同的區域。這說明RSM與FRSM的揮發性物質存在顯著差異。發酵1 d的樣品揮發性組分位于第二象限，遠離發酵3 d和5 d的樣品，表明發酵前期對揮發性風味物質有顯著的影響。樣品3 d組和5 d組雖然位于不同的象限內，但它們之間的距離較近，說明發酵3 d后揮發性成分的含量和組成趨于穩定。以上結果表明，在電子鼻數據上使用PCA可以區分RSM和FRSM以及不同發酵時間的FRSM。

2.3 混菌靜態發酵對雙低菜籽粕滋味的影響

由圖5-A可知，AHS、SCS、ANS和NMS 4種傳感器對4種樣品具有較好的響應。其中AHS和SCS的響應值在發酵前后發生了明顯變化，隨著發酵時間的延長，響應值逐漸增大。雖然ANS和NMS的響應值較高，但在發酵前后無明顯變化。說明菜籽粕本身就含有一定濃度的糖類、氨基酸、核苷酸和有機酸等甜味和鮮味貢獻物[19]。

圖5 不同發酵時間菜籽粕樣品的電子舌的雷達圖（A）和PCA圖（B）Fig. 5 Radar fingerprint chart (A) and PCA (B) of electronic tongue data for rapeseed meal at different fermentation times

如圖 5-B所示。PC1和 PC2的貢獻率分別為83.92%和 8.73%，兩者之和高達 92.65%，表明 PC1和PC2的總貢獻率幾乎包含了樣品的所有信息。RSM落于第一象限，與不同時間發酵菜籽粕的中心相距較遠，表明發酵前后菜籽粕的芳香性物質發生了很大變化。發酵1 d的發酵菜籽粕樣品位于第二象限，與發酵第3、5天的發酵菜籽粕樣品相距較遠，能夠明顯區分開。發酵第3天和第5天的發酵菜籽粕都位于第四象限，且相距較近，說明它們滋味的相似性很高。

2.4 發酵菜籽粕對大鼠體重和免疫器官指數的影響

如表2所示，發酵5 d的菜籽粕等氮代替大鼠飼糧中25%的豆粕對大鼠的免疫器官指數和后期（21—42 d）平均日增重無明顯的影響，但可以顯著提高大鼠平均日采食量和前期（0—21 d）的平均日增重。

2.5 發酵菜籽粕對大鼠腎臟、肝臟和胸腺的影響

圖6 各組小鼠器官組織形態學變化（HE染色，×200）Fig. 6 Spleen morphology of mice in all groups (HE staining, ×200)

表2 發酵菜籽粕對大鼠體重、采食量和免疫器官指數的影響Table 2 Effects of fermented rapeseed meal on body weight, feed intake and immune organ index in rats

兩組肝臟 HE染色結果顯示（圖6），肝細胞形態完整，細胞核無增大，肝小葉組織形態良好，無炎性細胞浸潤。兩組腎臟HE染色結果顯示，腎臟組織結構完整清晰，未見管型，間質無炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞胞質染色均勻，胞核居中，未見空泡樣變性、凋亡與壞死。兩組胸腺組織HE染色結果顯示正常，皮質、髓質界限清晰。

3 討論

采用靜態發酵顯著降低了發酵菜籽粕中硫甙葡萄糖苷和植酸的濃度，與菜籽粕相比，分別降低了45.26%和41.37%。本研究中硫代葡萄糖苷的降解率低于陸豫等[5]的研究結果，一方面是由于雙低菜籽粕本身硫甙葡萄糖苷的濃度（低于30 μmol·g-1）遠遠低于普通菜粕；另一方面可能是由于微生物的選擇和優化發酵條件的指標不同。植酸降解率高于HU等[20]的研究，枯草芽孢桿菌不僅可以產生芥子酶來降解硫甙葡萄糖苷等化合物[21-22]，還可以分泌植酸酶[23]，能夠分解植酸并釋放植酸中的磷，提高動物對磷的利用率。菜籽粕中富含粗纖維，可能會影響營養物質（主要是蛋白質和氨基酸）的消化率。在本研究中，枯草芽孢桿菌產生的纖維素酶顯著降低了菜籽粕中粗纖維的含量。菜籽粕中粗蛋白含量的增加是由于發酵過程中一些物質被分解產生揮發性氣體，導致蛋白質濃度在一定程度上濃縮。菜籽粕中多肽含量從 2.7%增加至10.3%，明顯高于WANG等[2]的研究（6.6%）。發酵過程中肽水平的增加是由微生物發酵產生的蛋白酶水解蛋白質引起，菜籽多肽可能具有某些生物活性，因此，菜籽多肽是評價菜籽粕營養價值的重要指標之一。此外，未發酵菜籽粕中主要含有高分子量蛋白質，經過發酵工藝，蛋白質被水解成氨基酸和分子量在 180—7 000 Da范圍內的小肽。從圖2可以看出，第3天時1 586 Da之前的峰值已經不存在，表明這些蛋白質對微生物蛋白酶降解的敏感性[7]。當發酵時間達到第5天時，分子量在500—108 Da的小肽和氨基酸在菜籽粕中含量最豐富。這是由于枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉菌都具有產蛋白酶的能力，蛋白酶能夠將大分子的蛋白質分解為多肽，并進一步裂解為小分子寡肽和氨基酸殘基。與大分子蛋白質相比，小肽具有更高的營養價值，因為小肽不僅能被動物腸道直接吸收，而且具有調節生理功能、增強免疫力、促進氨基酸吸收等作用。菜籽多肽的生理活性取決于多肽分子量大小及氨基酸序列。菜籽粕比豆粕中氨基酸的組成更加有利和合理。菜籽粕中含有較多的甲硫氨酸和半胱氨酸，但含有較少的賴氨酸。賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸是限制某些動物飼料營養效率的 3種氨基酸[24]。賴氨酸和甲硫氨酸是蛋白質飼料的重要營養強化劑[25]，蘇氨酸則是維持家畜和家禽生長和免疫功能的必需氨基酸[26]。有些家禽，比如肉雞，本身不能產生精氨酸，所以需要通過進食含有該氨基酸的膳食進行補充[27]，因此，提高精氨酸在菜籽粕中的含量對今后將發酵菜籽粕運用于雞飼料生產中有重要的意義。在本研究中，菜籽粕中必須氨基酸總量從發酵前的9.17%提高到發酵后的11.57%，提高率為26.17%，使得氨基酸的比例更為合理。總氨基酸含量的增加主要是微生物發酵合成支原體蛋白，這與 HE等[7]的研究結果相似。

發酵的菜籽粕中新檢測到川芎嗪，川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TTMP）又名四甲基吡嗪，是一種雜環含氮化合物，被廣泛用作風味添加劑，具有烘烤、花生、榛子、可可等誘食性香氣[28]。此前有報道稱TTMP對食物的整體香氣有顯著貢獻[29]。TMPP也被認為是發酵大豆和可可豆中的關鍵揮發性化合物，含量隨著枯草芽孢桿菌數量的增加而增加[30-31]。曾有報道稱枯草芽孢桿菌能通過微生物代謝從頭合成 TMPP[32-33]。菜籽粕作為靜態發酵培養基，富含糖、蛋白質和氨基酸，為枯草芽孢桿菌形成TTMP提供了充足的底物。TTMP在發酵菜籽粕中含量很高，它不僅僅是一種天然風味化合物，也是一種具有重要臨床應用價值的生物活性成分[34-35]。近期有報道稱，補充TTMP可顯著降低肉仔雞鼠傷寒沙門氏菌負荷和炎癥反應[36]。此外，在食醋和白酒發酵過程中也發現了TTMP，它通常具有較低的風味閾值，因此被認為對醬香型風味有重要的貢獻，并將它的含量作為一項功能性指標來評價食醋和白酒的質量[29,37]。因此，TTMP的產生對提高發酵菜籽粕的營養價值和整體風味具有重要作用。綜上所述，本研究所采用的菌種類型及工藝可以提高菜籽粕的營養價值。

有研究表明，枯草芽孢桿菌可以改善豆粕的的風味品質，提高豆粕中吡嗪類的種類和含量[30]。經雅致放射毛酶發酵的豆乳，酯類的含量明顯增提高[38]。本研究將枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉菌混菌發酵菜籽粕，得到的發酵菜籽粕兼具枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉的發酵香氣，豐富了發酵菜籽粕的風味。電子舌的作用機理與鼻的作用機理相似，能夠通過電子傳感器檢測人類的味覺。本研究中，傳感器 AHS和 SCS的響應值隨著發酵時間的延長而逐漸升高，其中AHS代表酸味，WANG等[2]利用微生物發酵菜籽粕促進酸味，認為酸味可以提高適口性，增加消費者的接受度。SCS代表苦味，發酵菜籽粕中苦味的增加可能是由于發酵后苦味氨基酸含量升高。雖然ANS和NMS在發酵前后無明顯變化，但是響應值較高，說明菜籽粕本身就含有一定濃度的糖類、氨基酸、核苷酸和有機酸等甜味和鮮味貢獻物。

靜態發酵菜籽粕等氮代替基礎飼糧中25%的豆粕可以明顯提高大鼠的平均日增重日增重和平均日采食量，這與HU等[20]的研究結果相似。這可能與菜籽粕中蛋白質的降解導致消化率的提高有關。HONG等[39]發現，發酵可以將SBM中的多肽分子量降低，小肽更有利于新斷奶仔豬的生長。此外，靜態發酵能有效的降低抗營養物質，促進酸味增加，有利于提高菜籽粕的適口性。發酵后的特殊香氣也可能是導致動物采食量增加的原因之一。如果飲食中硫甙葡萄糖苷的含量高，會導致腎臟和肝臟受損。組織病理學能可靠地反應機體器官與組織的損傷程度以及功能性變化，也是間接反應毒性程度所采用的主要方法。顧斌[8]曾在小鼠飼料中添加了15%的菜籽粕和發酵菜籽粕，發現與菜籽粕相比，添加同量的發酵菜籽粕能夠減輕菜籽粕對小鼠腎臟、肝臟和胸腺的損傷。本研究中，HE染色結果表明兩組大鼠的腎臟、肝臟和胸腺無顯著差異，表明發酵菜籽粕未對大鼠產生慢性毒性作用。

4 結果

從品質角度看，本研究選用的有益菌（枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉菌）及發酵工藝顯著降低了菜籽粕的抗營養物質的含量，提高了營養成分的含量；并對滋味和氣味產生一定影響，特別是發酵后新產生的川芎嗪，不僅提高了菜籽粕的營養價值，并對菜籽粕的風味產生積極的影響。從安全角度看，發酵菜籽粕添加到大鼠飼糧中可以促進大鼠的生長，且不會對大鼠的腎臟、肝臟和胸腺造成損傷。