蓮草直胸跳甲Halloween基因家族鑒定及表達分析

劉亦然，張虹，靳繼蘇，周忠實，郭建英

（中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

0 引言

【研究意義】空心蓮子草（Alternanthera philoxeroides）為世界性惡性入侵雜草[1]，原產于南美洲，20世紀30年代傳入我國[2]，對我國農林牧漁業產生了巨大危害[1,3-4]。蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）隸屬鞘翅目葉甲科，是空心蓮子草的專食性天敵，其幼蟲、成蟲取食空心蓮子草的葉片及嫩莖，控草效果較為顯著[5]。蛻皮激素（ecdysone）參與調控昆蟲中多種生命活動，如繁殖、滯育、先天免疫等[6-7]。Halloween基因家族是蛻皮激素合成通路中重要成員[8-10]，開展蓮草直胸跳甲Halloween家族基因研究，將有助于了解蛻皮激素對昆蟲的調控機制，為生防天敵的擴繁提供新思路。【前人研究進展】激素調節貫穿于昆蟲的整個生活史，昆蟲體內的激素包括保幼激素、蛻皮激素和腦激素等；其中，蛻皮激素最早由BUTENANDT等于 1954年報道[11]，可參與調節昆蟲的蛻皮、變態、滯育和繁殖等生理過程[12]，具體包括調節昆蟲的細胞增殖、分化與凋亡、蛻皮及變態、神經系統的重塑、滯育及免疫應答等多項生命活動[13]。蛻皮激素的主要活性物質為 20-羥基蛻皮酮（20E），其在昆蟲的幼蟲期由前胸腺產生，而在昆蟲羽化為成蟲后，其體內的蛻皮激素由卵巢合成，參與卵巢的發育與繁殖[14]。研究發現，在煙草天蛾（Manduca sexta）和黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲期蛻皮激素參與啟動幼蟲不同齡期之間的蛻皮及變態[15]；用 20E處理結扎的家蠶（Bombyx mori）雌蛹，血淋巴中卵黃原蛋白（Vg）含量明顯提高，卵巢的發育速度明顯加快[16]。在20E生物合成方面的突破性進展是細胞色素 P450超家族編碼的Halloween基因家族的發現[17]。如已證實，在黑腹果蠅中 Halloween家族基因表達產物經過一系

列生化反應生成蛻皮激素；同時，當CYP302A1被敲除后，黑腹果蠅出現蛻皮激素滴度降低的現象[18]。此外，在家蠶化蛹前對其 Halloween基因家族成員CYP314A1進行干擾，出現家蠶不能正常化蛹以及雌蛾卵巢發育不正常的現象[19]。在植食性昆蟲中，Halloween基因家族主要包括CYP307（spook）、CYP306A1（phantom）、CYP302A1（disembodied）、CYP315A1（shadow）以及CYP314A1（shade）[20]；其中，CYP307、CYP306A1、CYP302A1、CYP315A1通過一系列的生化反應參與合成無活性的蛻皮酮，最終由CYP314A1催化合成活性物質20E[20-21]。但不同物種中其體內Halloween基因家族存在一定差異，如瓦螨（Varroa destructor）和煙草天蛾中均只鑒別到3個 Halloween基因家族成員[22-23]。蓮草直胸跳甲作為空心蓮子草的生防天敵，我國于1987年從美國佛羅里達州引進該跳甲并在江蘇、云南、四川和湖南等地釋放[24]。田間調查發現，該跳甲成蟲和幼蟲的蟲口密度越大，其控草速度越快，控草效果越顯著[25]。【本研究切入點】目前，對于昆蟲細胞色素 P450基因的研究主要集中在其對農藥的抗藥性以及對不利環境的抵抗等方面，迄今在蓮草直胸跳甲中未有關于 P450基因參與蛻皮激素合成通路的報道，對其蛻皮激素合成通路中Halloween基因家族的數量、表達模式等尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】田間調查表明，在我國湖南地區，蓮草直胸跳甲的種群密度呈季節性波動趨勢，夏季數量明顯減少[26]，這是環境因素對其卵孵化、幼蟲發育、蛹羽化和成蟲繁殖影響的綜合體現。由于蛻皮激素參與調節昆蟲的蛻皮、變態、滯育和繁殖等生理過程[14]，本研究分析參與蛻皮激素合成的Halloween基因家族在蓮草直胸跳甲中的表達模式，解析Halloween基因家族對蓮草直胸跳甲種群動態的影響，為進一步應用 RNA干擾技術分析其基因功能打下基礎，進而為探尋促增蓮草直胸跳甲種群數量的方法提供新思路，從而更好地對入侵雜草空心蓮子草進行生物防治。

1 材料與方法

1.1 供試植物

空心蓮子草根莖于2018年6月采自福建省福州市福建省農業科學院植物保護研究所南通中試基地，攜帶至河北省廊坊市中國農業科學院植物保護研究所廊坊科研中試基地溫室，在塑料盒（30 cm×30 cm×30 cm）中用營養土（黑土∶蛭石=1∶1）栽培，并采用扦插方式擴大栽種規模。空心蓮子草莖稈達4—7節間長時用于試驗。

1.2 供試昆蟲

蓮草直胸跳甲成蟲于2018年10月采自湖南省長沙市湖南省農業科學院附近，攜帶至中國農業科學院植物保護研究所廊坊科研中試基地進行室內飼養，飼養溫度為（25±1）℃，相對濕度為75%±5%，光周期為12L∶12D，連續飼養3代后用于試驗。

1.3 樣品采集

為測定Halloween基因在蓮草直胸跳甲不同發育階段的表達量，自產卵第1天起，每隔24 h逐日收集蓮草直胸跳甲各個時期的樣品，分別包括卵期第0—4天、幼蟲第1—13天、蛹期第1—7天和成蟲期第1—6、8、10天的雌蟲。上述各天數的樣品包括2—20個個體，3個生物學重復。

為測定Halloween基因在蓮草直胸跳甲不同組織的表達量，將雌成蟲在1×PBS磷酸緩沖液（pH 7.4）中進行解剖，分別取頭、胸、中腸、卵巢以及脂肪體，每份組織從5—15個個體中收集，3個生物學重復。

收集的所有樣品立即在液氮中冷凍，-80℃中保存備用。

1.4 總RNA提取及第一鏈cDNA合成

利用Trizol法提取蓮草直胸跳甲不同發育時期以及各組織的總 RNA。采用超微量紫外分光光度計Nanophoto meter P330（Implen，Germany）和1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA的純度和完整性。參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒說明書，RNA定量為1 μg，反轉錄合成第一鏈cDNA并于-20℃保存備用。

1.5 目的片段的擴增

將本實驗室前期建立的蓮草直胸跳甲轉錄組數據與NCBI庫進行比對，得到蓮草直胸跳甲中共有6個Halloween基因家族成員，分別為CYP302A1、CYP306A1、CYP307A1、CYP307A2、CYP314A1、CYP315A1，利用Primer Premier 5.0軟件設計，Oligo軟件分析引物，并由上海生工生物工程公司合成所需引物。以反轉錄得到的cDNA為模板，用表1中特異性引物進行PCR擴增。擴增體系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，引物（10 μmol·μL-1）1 μL，Taq 酶 0.5 μL，cDNA 模板 0.5 μL，ddH2O 補至25 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環；72℃延伸10 min。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶進行PCR產物回收，連接至PEASTT3載體并轉化至大腸桿菌感受態細胞，得到陽性克隆后測序。

1.6 保守性分析與進化分析

通過在線分析軟件Emboss Transeq將上述得到的核酸序列轉換為氨基酸序列，后將其編碼的氨基酸序列在NCBI中進行保守結構域預測以及Blastp分析，分別找到與 Halloween家族基因具有同源性的昆蟲Halloween基因序列。使用MEGA6.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進行1 000次重復計算后構建系統進化樹。

1.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測目的基因的表達水平

根據擴增得到的目的基因設計特異性定量引物，同時選擇在蓮草直胸跳甲體內表達穩定的β-actin作為內參基因（表2），并以上述提取的不同發育歷期、不同組織的總RNA經反轉錄得到的cDNA為模板，利用qRT-PCR技術檢測蓮草直胸跳甲Halloween基因家族成員在不同組織以及不同發育階段的表達變化。選取TransStart Tip Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒進行實時熒光定量。擴增體系：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×）0.5 μL，引物（10 μmol·μL-1）0.5 μL，cDNA 1 μL，補充 RNase-free water至 20 μL，擴增程序采用兩步法。

1.8 數據分析

利用2-ΔΔCT法對測定出的目的基因的相對表達量進行計算，計算公式：以該基因表達量最低的時期或組織作為對照，測定的基因表達量定為1。采用R version 3.5.1軟件進行數據分析，同一基因在不同日齡間的表達量差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的LSD法。

表1 用于克隆蓮草直胸跳甲中Halloween基因的完整或部分ORF引物Table 1 Complete or partial ORF primers for the cloning of the Halloween genes in A. hygrophila

表2 用于檢測蓮草直胸跳甲中Halloween基因表達水平所用引物Table 2 Primers used to detect the expression level of the Halloween genes in A. hygrophila

2 結果

2.1 Halloween基因家族系統發育樹分析

圖1 蓮草直胸跳甲Halloween基因家族的結構域Fig. 1 Domain architecture of A. hygrophila Halloween gene family

圖2 基于氨基酸序列構建的Halloween基因家族的系統進化樹（鄰接法）Fig. 2 Phylogenetic tree of the Halloween gene family based on amino acid sequence (neighbor-joining)

基于前期得到的轉錄組數據并結合NCBI分析，在蓮草直胸跳甲中共鑒定得到6個Halloween基因家族成員，設計引物（表 1）擴增得到其中間片段。為了明確蓮草直胸跳甲中Halloween基因家族的進化情況，分別進行了結構域分析和系統進化樹分析（圖1、圖 2）。通過分析Halloween家族基因氨基酸序列可以看出其均屬于細胞色素P450超家族；AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜區域。由圖 2中可以看出，Halloween基因家族各基因可以分別與其他物種對應的基因聚為一支，形成6個分支，表明蓮草直胸跳甲中 Halloween基因在漫長的進化過程中符合P450超家族的特點，即具有一定的保守性；6個Halloween基因分開聚成6支，表明它們可能分別存在不同的進化模式并各自具有不同的生物學功能。

2.2 Halloween基因家族時空表達分析

圖3 蓮草直胸跳甲Halloween基因家族在不同發育時期的相對表達量Fig. 3 Relative expression of the Halloween gene family at different developmental stages of A. hygrophila

2.2.1 不同時期 Halloween基因家族的表達分析由圖3可知，Halloween基因家族成員在蓮草直胸跳甲不同發育階段的表達量差異較大。其中，AhCYP302A1的mRNA表達量在1日齡卵期較高，蛹期第6、7天最高，在成蟲期急劇下降；AhCYP306A1的mRNA表達量呈波動趨勢，在幼蟲末齡及蛹前期表達量較高，其中以幼蟲第10天表達量最高，顯著高于其他時期的表達量；AhCYP307A1表達量在卵期第2、3天最高，之后呈波動下降趨勢，在成蟲期表達量趨于穩定；AhCYP307A2表達量整體呈波動趨勢，其中以蛹期第2天表達量最高；AhCYP314A1在產卵初期的表達量顯著高于其他時期，在卵開始發育后的整個生活史中，AhCYP314A1的表達量整體呈先波動下降后波動上升的趨勢；AhCYP315A1在卵期第0天表達量最高，之后持續低表達直至雌蟲羽化第2天，在雌成蟲發育期間均高表達。

2.2.2 不同組織 Halloween基因家族的表達分析對Halloween基因家族6個基因在蓮草直胸跳甲雌成蟲頭、胸、中腸、卵巢、脂肪體 5種組織中表達量的檢測表明（圖4），Halloween基因家族成員在中腸中表達量均極低。AhCYP302A1在胸部表達量最高，其次為頭部和卵巢，但在這 3種組織中的表達量差異不顯著。AhCYP306A1在卵巢和脂肪體內高表達，顯著高于在頭部和中腸的表達量。AhCYP307A1、AhCYP307A2分別在頭部和卵巢表達量極高，在其余組織中表達量均較低。AhCYP314A1在卵巢中表達量最高，其次為脂肪體，在頭部和中腸中表達量極低。AhCYP315A1在卵巢中表達量最高，在胸部和脂肪體中表達量相近，在中腸表達量最低，僅為在卵巢中表達量的千分之一。

3 討論

圖4 蓮草直胸跳甲Halloween基因家族在不同組織的相對表達量Fig. 4 Relative expression of the Halloween gene family in different tissues of A. hygrophila

蓮草直胸跳甲是入侵雜草空心蓮子草的專一性天敵，其成蟲和幼蟲均取食葉片，若在同一地點連續釋放 2—3年，空心蓮子草基本可得到控制[28]。目前，在我國湖南長沙等地空心蓮子草一年四季均大量發生，而蓮草直胸跳甲的種群動態卻呈波動趨勢。Halloween基因家族作為蛻皮激素合成通路中重要的一支，在昆蟲生長發育和繁殖中具有重要作用，因此會對昆蟲種群動態產生影響[29]。雖然已在多種昆蟲中發現并鑒定Halloween家族基因，但目前尚無有關蓮草直胸跳甲中該基因家族的研究報道。

本研究利用RT-PCR技術克隆獲得蓮草直胸跳甲蛻皮激素合成途徑Halloween家族6個基因AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1、AhCYP315A1的中間片段，其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2屬于細胞色素P450超家族中 CYP2集團，AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1屬于線粒體集團。進化分析發現蓮草直胸跳甲中Halloween基因家族具有一定的保守性，表明其在不同昆蟲中可能具有相似的功能；但在不同昆蟲中Halloween基因家族不同，有些酶在昆蟲進化過程中已被消除、復制或發生改變；如CYP307家族中的spot在鱗翅目昆蟲以及果蠅科中不存在，但在岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）中檢測到此基因[12]；此外，在蓮草直胸跳甲中發現的CYP307A2，在家蠶以及煙草天蛾中卻不存在[30]，表明蛻皮激素的合成路徑在不同昆蟲中存在物種特異性和進化差異。

蛻皮激素可在昆蟲整個生活史中表達[31]。本研究采用實時熒光定量PCR技術測定了Halloween基因在蓮草直胸跳甲不同蟲態和雌成蟲不同組織中的表達量。結果發現，Halloween基因在蓮草直胸跳甲各蟲態均有表達，這與家蠶中的表達模式相似[19]，表明Halloween基因家族對蓮草直胸跳甲整個生活史均有影響。在蓮草直胸跳甲中AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A2在幼蟲以及蛹期表達量相對卵期、成蟲期較高，表明三者可能主要參與了蓮草直胸跳甲的蛻皮過程；其中，AhCYP306A1、AhCYP307A2在末齡幼蟲及化蛹初期的表達量顯著上調可能為其蛻皮與變態化蛹作準備。AhCYP307A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在成蟲以及卵期表達量相對較高，三者可能主要與蓮草直胸跳甲的卵巢發育、卵發育等繁殖過程有關；AhCYP307A1在卵期第2、3天高表達以及AhCYP302A1在卵期第1天高表達的模式，推測其可能參與了蓮草直胸跳甲卵期的胚胎發育過程，這與黑腹果蠅中缺陷CYP302A1（Dib）以及CYP307A1（Spo）時胚胎發育不正常的現象相符[18]。蓮草直胸跳甲Halloween基因家族中的6個成員在同一發育時期、同一組織中表達存在差異，推測其可能在蓮草直胸跳甲中所行使的功能不同。如對白背飛虱（Sogatella furcifera）中若蟲Halloween基因時空表達分析表明，CYP307A1（Spo）在其2—4齡均有表達，其中在4齡以胸部表達量最高；給白背飛虱飼喂dsSpo后，若蟲發育顯著延遲，其中24%的若蟲停留在3齡[32]。在不同組織中，蓮草直胸跳甲中Halloween基因家族除AhCYP307A1外大多在卵巢中高表達，這與NIWA等報道的類固醇類激素參與調節蛻皮動物成蟲階段的生殖過程（如種系發育、先天發育等）[12]以及成蟲蛻皮激素的初級來源為卵巢相符[33-34]。昆蟲頭部作為感知嗅覺、觸覺、聽覺的部位，AhCYP307A1在蓮草直胸跳甲頭部的特異性高表達是否表明其與頭部行使這些功能有關還有待進一步驗證。同樣值得關注的是，在一些非內分泌的組織中，如中腸，也檢測到Halloween基因的表達，這些組織是否可以作為原發性或繼發性合成蛻皮激素的部位有待進一步研究。

4 結論

克隆并鑒定得到蓮草直胸跳甲中6個Halloween基因家族成員，分析發現其均屬于 P450超家族且具有一定保守性。實時熒光定量PCR結果表明，蓮草直胸跳甲6個Halloween基因家族成員的表達在不同發育時期存在差異，但大多在卵巢中高表達；表明其在不同發育時期及不同組織中可能具有不同的功能，根據表達模式推測可能對蓮草直胸跳甲的蛻皮與繁殖具有一定影響。