采用優化的數字PCR方法分析轉基因小麥外源基因拷貝數

琚鵬舉，寧蕾，葛林豪，許成杰，史華偉，梁凱歌，馬亮，劉陶然，陳明，孫黛珍

（1山西農業大學農學院，山西太谷 030800；2中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081；3中央民族大學，北京 100081；4石家莊市農林科學研究院，石家莊 050047）

0 引言

【研究意義】目的基因的拷貝數一直是植物基因組研究的重要內容。外源基因整合進入受體基因組的位置和拷貝數會影響目的基因的表達以及遺傳穩定性，而插入基因的拷貝數相對其插入位點而言影響更為重要[1]。當外源基因以低拷貝數（1—2個）整合到受體基因組時，通常能夠穩定高效轉錄表達，多拷貝數的整合則會造成基因不穩定表達，甚至沉默[2]。因此，鑒定轉基因產品的外源基因插入拷貝數非常重要[3]。由于小麥基因組龐大復雜，優化和建立高通量拷貝數分析方法對于對小麥轉基因育種研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，微滴式數字 PCR（droplet-based digital PCR，ddPCR）是最新興起的一項核酸檢測技術[4-6]。該技術不依賴任何校準物，采用直接計數單個分子的原理，實現了對核酸檢測的絕對定量[7-8]。ddPCR已被廣泛應用于生命科學研究的多個領域，如核酸絕對定量、稀有突變檢測和拷貝數檢測等[9]。ddPCR具有高精確度的特點，在檢測目的基因拷貝數時，利用目標基因與參考基因的雙重反應，通過計算它們的比值，即可快速獲得目標基因拷貝數。這種方法由于試驗結果重復性好，已經成為了檢測基因拷貝數的首選方法[10]。與傳統方法相比較，ddPCR具有明顯優勢，主要體現在操作流程更加簡單，無需構建標準曲線，且是對待檢測的核酸分子直接進行絕對定量，試驗結果更加準確可靠[11]。此外，ddPCR在線性范圍、檢測極限和定量極限等方面均優于qRT-PCR方法[12]。諸多研究表明，ddPCR已用于玉米、水稻等作物轉基因插入拷貝數的檢測[13-14]。SUN等[15]的研究表明運用 ddPCR技術可以在甘蔗復雜基因組中明確確定內源參考基因拷貝數，COLLIER等[16]研究中使用雙重ddPCR獲得了水稻、小麥、玉米、番茄、馬鈴薯和柑桔類物種的高質量轉基因拷貝數測量值。其中提到 ddPCR分析產生的拷貝數測量值非常接近整數值，通常與使用Southern blot雜交得出的結論相近。并且，基于ddPCR的方法在基因組非常大的物種（如小麥和玉米）中也能很好地發揮作用，但傳統的DNA印跡雜交方法在這一方面卻極富挑戰性。因此快速準確地確定轉基因拷貝數并鑒定大量樣品的半合子和純合子的能力使 ddPCR成為植物生物學研究人員的強大工具。【本研究切入點】六倍體小麥因其基因組龐大復雜（約17 Gb），利用傳統Southern blot等方法檢測拷貝數費時費力，無法達到高通量檢測的要求，當需要對大量的轉化試驗進行拷貝數分析時，傳統方法無法滿足要求。【擬解決的關鍵問題】本研究以中國農業科學院作物科學研究所小麥抗逆分子育種課題組利用農桿菌介導法獲得的轉nib8小麥為試驗材料，以小麥PINb-D1b（籽粒硬度）為參考基因[15]，期望通過數字 PCR技術建立一種快速穩定的小麥基因拷貝數檢測方法，為促進小麥基因組研究以及基因工程研究提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年10月，中國農業科學院順義基地種植轉nib8小麥株系（由中國農科院作物科學研究所小麥抗逆分子育種課題組提供）和揚麥16（受體）。

1.2 內參基因和目標基因引物設計

選取位于小麥 D基因組中的單拷貝純合基因PINb-D1b（籽粒硬度）作為試驗內參基因[17]，通過引物的篩選和比較，確定專一性和特異性強的引物（表1）。設計Wx012（蠟質基因）和SSII（淀粉合成酶）2個內參基因的引物和探針，確保探針的特異性（表1）。

表1 數字PCR 探針引物序列Table 1 Sequences of probes and primers used in digital PCR

1.3 樣本DNA的提取

結合CTAB法和全自動核酸提取儀提取法提取樣本DNA[18]。

1.4 片段化基因組

用EcoRⅠ（NEB公司）對葉片基因組DNA進行核酸內切酶預處理，每微克DNA加入1個單位EcoRⅠ。37℃處理過夜，65℃ 30 min使酶失活，并將模板DNA稀釋為 20 μg·μL-1。

1.5 制備反應體系及PCR反應

采用以DNA為模板的探針法。反應體系見表2，反應條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，57℃ 1 min，40個循環；98℃ 10 min。為保證高效的模板擴增，PCR儀的升降溫速度需低于2℃·s-1。

表2 PCR擴增反應體系Table 2 PCR amplification reaction system

1.6 微滴分析

將 96孔板放入微滴分析儀中，讀取微滴熒光信號，從而判斷微滴的陽性或陰性。使用 QuantaSoft V1.3.2軟件計算每個樣品目的序列的微滴數（拷貝/μL）[19]，泊松分布的置信區間為 95%；然后根據內參基因的拷貝數計算待測目的基因的拷貝數。

2 結果

2.1 引物的特異性篩選

選用轉nib8小麥株系為模板，使用表1的4個基因引物進行PCR擴增（圖1）。結果發現擴增出的條帶均為單一目的條帶，表明引物具有特異性。

圖1 4對引物的特異性擴增Fig. 1 Specific amplification results of four pairs of primers

2.2 退火溫度的篩選

通過對退火溫度的梯度分析，在6個溫度條件下，nib8均表現出良好的擴增圖形，且隨著退火溫度的升高，nib8的陰性微滴和陽性微滴區分的愈發明顯，擴增越來越特異（圖2-A）。圖2-B中內參基因隨著退火溫度的升高，擴增效率變化不明顯。因此，為使nib8和內參基因均能表現出良好的擴增效果，最終以59℃作為最優退火溫度。

2.3 靈敏度（檢測低限）和準確性檢測

2.3.1 DNA模板濃度的篩選 由圖3可知，nib8在4個不同模板濃度下均擴增出良好的微滴分離現象，隨著濃度的增加，微滴數增加。然而，nib8在160 ng模板濃度時，陽性微滴和陰性微滴已無法明顯分開，在320 ng模板濃度時，該現象愈發明顯。模板濃度越高，體系擴增效果越差，微滴不能明顯分開，而模板為20 ng時的微滴數較少，無法明顯看出擴增效果，因此，最終選定40 ng為最佳模板濃度。

2.3.2 特異性檢測 使用QuantaSoft V1.3.2軟件對6個轉nib8小麥株系的拷貝數進行分析。由圖4可以看出陽性微滴數和陰性微滴數區分明顯，說明體系穩定。由表3可以看出數字PCR檢測結果中有3個株系為1個拷貝，可以用于進一步基因功能分析。

2.4 體系驗證及應用

2.4.1 不同檢測方法的比較 由表 4中可以看出數字 PCR的檢測結果與通過染料法和探針法進行的real-time PCR分析結果一致。由圖5可以看出轉nib8小麥第16號株系的Southern blot結果也與數字PCR結果一致，均是1個拷貝。

圖2 不同退火溫度條件下nib8（A）和內參基因（B）的數字PCR檢測Fig. 2 Digital PCR detection of nib8 (A) and internal reference genes (B) at different annealing temperatures

圖3 不同模板濃度條件下nib8（A）和內參基因（B）的數字PCR檢測Fig. 3 Digital PCR results of nib8 gene(A) and control gene (B) at different template concentrations

圖4 轉nib8株系特異性檢測Fig. 4 Specific detection of nib8 strains was performed

表3 轉nib8株系的數字PCR檢測低限測定結果Table 3 The results of low limit determination by digital PCR were obtained by transplanting nib8 strain

2.4.2 內參基因的選擇 在內參基因的選擇上，除小麥D基因組中的單拷貝純合基因（PINb-D1b）外，同時還開發了其他小麥內源基因作為拷貝數檢測的內參基因。

以Wx012和SSII為內參基因檢測部分轉nib8小麥株系目標基因的拷貝數（圖6和圖7），其結果與用PINb-D1b為內參基因的分析結果一致，都是1個拷貝，證明這3個基因都可作為內參基因用于小麥目標基因拷貝數數字PCR分析。

圖5 轉nib8小麥第16號株系的Southern blot檢測Fig. 5 Southern blot results of nib8 transgenic wheat line 16

表4 探針法、染料法和數字PCR的結果對比Table 4 Comparison between fluorescence quantitative method such as probe method and dye method, and digital PCR method

圖6 內參基因的拷貝數分析Fig. 6 Copy number analysis of internal reference genes

圖7 轉nib8株系的拷貝數分析Fig.7 Copy number analysis of transferred nib8 lines

2.4.3 靶基因不同區段的檢測效果驗證 在nib8的不同區段進行引物探針設計，分別以PINb-D1b、Wx012和SSII為內參基因檢測nib8拷貝數，結果均一致（圖8-A，圖8-B），第12號轉nib8小麥株系的拷貝數都是7（圖8-C）。

圖8 在nib8不同位置設計引物的結果圖（第12號轉nib8株系）Fig.8 Results of designing primers at different positions of nib8 gene (take 12 strains as an example)

3 討論

3.1 不同拷貝數檢測方法的比較

目前，小麥拷貝數檢測方法很多，但用數字PCR檢測轉基因小麥外源基因拷貝數報道較少。經典的外源基因拷貝數檢測方法主要有 qRT-PCR和 Southern blot。其中qRT-PCR分析方法的步驟較為繁瑣，首先需要準備標準 DNA樣品，然后利用此樣品構建標準曲線，而標準曲線的建立又涉及體系的摸索與優化，需要耗費大量的時間和精力，所需試驗周期較長[20]；另外，借助標準曲線進行定量本身就是一種相對定量方法，所以試驗結果并不準確[21]。而傳統的Southern blot方法不但對DNA需求量大，試驗操作步驟復雜，而且對人員操作的技術要求比較高[22]。與定量PCR不同，數字PCR無需標準曲線即可實現對DNA樣品絕對定量的靈敏、準確。一個PCR反應被分成許多獨立的反應，每個反應都有一個陽性或陰性的信號。應用泊松統計量，直接從陽性反應和陰性反應的數量計算出原始樣品中DNA分子的數量。本研究中數字PCR模板要求低，而且相比Real-time PCR的靈敏性（0.1 pg·μL-1）高，數字 PCR 靈敏性能達到 0.001 pg·μL-1，是Real-time PCR的100多倍。相比Southern blot，數字PCR試驗周期短，操作簡單，檢測通量高。

3.2 體系準確性的比較

一步多重PCR（multiplex PCR）又稱多重引物PCR或復合PCR，是指在同一PCR反應體系中添加2對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，且每對引物只對應1個[23]靶標片段，與常用的RAPD技術（1對引物對應多個擴增產物）[24]全然不同?？紤]到二重微滴式數字PCR不僅能避免單重ddPCR定量因二次取樣所產生的樣品內的誤差，而且可以消除不同樣品 DNA因取樣不一致而造成的樣品間的誤差，所以本研究采用二重PCR反應擴增，選用了3個不同的小麥單拷貝基因Wx012、PIN-b1和SSII作內參基因，其中以PIN-b1為內參基因時，Wx012和SSII的拷貝數為1（圖6）。又以這3個基因為內參基因檢測轉基因株系12的拷貝數時，結果也相同。為了檢驗表達是否一致，在nib8序列的不同區段設計引物，結果顯示一致。為了試驗結果的準確性，本研究選擇小麥基因組里的其他2個單拷貝基因Wx012和SSII作為內參基因檢測PIN-b1[25]。以此來檢測該體系的準確性。

3.3 數字PCR檢測小麥拷貝數方法的應用

本研究建立的檢測體系短時間內可以檢測幾百個樣品，大大提高了工作效率。本研究建立的拷貝數方法不僅可以檢測外源基因。也可以檢測內源基因的拷貝數。因此，本方法具有快速、靈活、高效、所需樣本量少等優點，而且已經在基因表達研究、基因組拷貝數鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、轉基因成分鑒定等諸多領域顯示出廣闊的應用前景[26-28]。BURNS等[29]應用數字 PCR來評估幾種轉基因分析方法的檢測限。

DOBNIK等[30]應用數字 PCR技術，針對歐盟授權的 12種轉基因玉米品系建立了轉基因成分多重定量分析方法。目前，該技術已經快速應用于各個領域。

4 結論

建立了針對小麥雙重微滴式數字 PCR檢測基因拷貝數的方法。確定了引物和探針的最佳終濃度分別為500和250 nmol·L-1，退火溫度為59℃。該檢測方法可以選用3個內參基因（Wx012、PIN-b1和SSII）。