頂空-氣相色譜法快速測定食品中甜蜜素的含量

何 浩，吳海智，唐吉旺，朱 禮，袁列江

(湖南省產商品質量監督檢驗研究院，長沙410007)

甜蜜素，其化學名稱為環己基氨基磺酸鈉，是食品生產中常用的甜味劑，其甜度是蔗糖的30～40倍。消費者如果經常食用甜蜜素含量超標的食品，就會對人體的肝臟和神經系統造成危害[1]。國家標準GB 2760－2014規定，甜蜜素在餅干、果凍、飲料類中最大使用量為0.65 g·kg－1，在腌制的蔬菜中最大使用量為1.0 g·kg－1，在面包、糕點中最大使用量為1.6 g·kg－1，在涼果類、話化類中最大使用量為8.0 g·kg－1。

食用檳榔作為湖南、海南等地的地方性特色食品，湖南省地方標準DB 43/132－2004和海南省地方標準DB46/T 75－2007中均明確規定其甜蜜素含量限值為8.0 g·kg－1。

目前，食品中甜蜜素的測定方法有自動液體進樣-氣相色譜法[2]、頂空-氣相色譜法[3-5]、比色法[6]、氣相色譜-質譜法[7-8]、液相色譜法[9]、液相色譜-質譜法[10]和離子色譜法[11]等。

液體進樣-氣相色譜法和氣相色譜-質譜法需要冰浴衍生化反應等較繁瑣的步驟，且衍生化產物為環己醇亞硝酸酯和環己醇的混合物，隨著時間的推移，環己醇亞硝酸酯會逐步轉化為環己醇，對定量造成影響。比色法的檢出限較高，不適用于微量甜蜜素的測定。液相色譜法也需經過衍生化反應和液液萃取等步驟，且液相色譜法分離度比氣相色譜法差，容易造成假陽性結果。液相色譜-質譜法的前處理簡單，但只適合于白酒等基質簡單的樣品，且該儀器昂貴，不利于方法的普及。離子色譜法對基質的除雜要求較高，過程繁瑣，且容易造成回收率偏低。因此，找到一種前處理簡單、定量準確并適用于各種復雜食品基質的測定甜蜜素含量的方法是非常有必要的。本工作對樣品前處理步驟進行了優化，采用頂空-氣相色譜-質譜法對衍生化產物進行定性，并推斷反應的機理;以甜蜜素的主要衍生化產物環己烯為目標待測物，建立了頂空-氣相色譜法測定食品中甜蜜素含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

HSS86.50 Plus型頂空進樣器;GC 2010Plus型氣相色譜儀，配火焰離子化檢測器(FID);SPB-3型全自動空氣源;SPH-300 型空氣發生器;7697A-7890A-5975C 型 頂 空-氣 相 色 譜-質 譜 聯 用 儀，配NIST 11譜庫;ATY224型電子天平;KQ-500VDV型超聲波清洗器;DC 2020型低溫恒溫槽。

甜蜜素標準儲備溶液:稱取0.100 0 g甜蜜素標準品，加入50 m L水，超聲溶解后，移入100 m L 棕色容量瓶中，定容搖勻，配制成1.000 g·L－1的標準儲備溶液。

甜蜜素標準溶液:移取25.0 m L 甜蜜素標準儲備溶液至250 m L 棕色容量瓶中，用水定容，搖勻，配制成100 mg·L－1的標準溶液。

甜蜜素標準品純度為99.1%，亞硝酸鈉和硫酸均為分析純;高純氮氣純度不小于99.999%，高純氦氣純度不小于99.999%;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)頂空條件 加熱箱溫度50 ℃;定量環溫度55 ℃;傳輸線溫度60 ℃;循環時間13.0 min;平衡時間30 min;定量閥體積1.0 m L。

2)氣相色譜條件 DB-1 石英毛細管色譜柱(15.0 m×0.53 mm，0.50 μm)，色 譜 柱 流 量1.99 m L·min－1;氣 化 室 溫 度150 ℃，FID 溫 度300 ℃;載氣為氮氣;氫氣流量40.0 m L·min－1，空氣流量400.0 m L·min－1，尾吹氣流量30.0 m L·min－1;分流進樣，分流比為20∶1。柱升溫程序:初始溫度為80 ℃，保持1 min;以40 ℃·min－1速率升溫至100 ℃，保持2 min;再以40 ℃·min－1速率升溫至200 ℃，保持2 min，共8 min。

3)氣相色譜-質譜條件 DB-5MS石英毛細管柱(0.32 mm×30 m，0.25 μm);色 譜 柱 流 量1.0 m L·min－1;氣化室溫度150 ℃;載氣為氦氣;分流進樣，分流比為100∶1。柱升溫程序:初始溫度為80 ℃，保持1 min;以25 ℃·min－1速率升溫至155 ℃，保持6 min，共10 min。電子轟擊離子源(EI)，EI 能 量70 e V;氣 相 色 譜-質 譜 接 口 溫 度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四 極 桿 溫 度150 ℃;溶劑延遲時間0 min;掃描方式為全掃描;掃描質荷比m/z30～250。

1.3 試驗方法

稱取粉碎均勻的固體樣品或液體樣品(包括含酒精的飲料)10.000 0 g，放入100 m L 帶刻度的比色管中，加水至90 m L，固體樣品超聲提取1 h，含二氧化碳液體樣品超聲提取10 min，冷卻后用水定容，搖勻。涼果類、話化類食品和食用檳榔的提取液需稀釋20倍后才可使用，其他樣品提取液均可直接使用。移取10.0 m L 樣品提取液至20 m L 頂空進樣瓶中，再依次加入100 g·L－1硫酸溶液1.0 m L和100 g·L－1亞硝酸鈉溶液1.0 m L，封蓋后振蕩搖勻，按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 試驗方法探究

國家標準GB 5009.97－2016第一法規定了測定甜蜜素的方法:甜蜜素在硫酸介質中與亞硝酸發生反應，利用反應生成的環己醇亞硝酸酯進行氣相色譜定性和定量分析;由于此方法衍生化過程中加入了氯化鈉，導致反應產物較為復雜，此時氯化鈉不再發揮鹽析作用，而是作為反應物生成了各種氯代產物，如氯代環己烷、2-氯環己醇、順式1，2-二氯環己醇、反式1，2-二氯環己醇等[12]。文獻[7]采用頂空-氣相色譜法研究了甜蜜素，并將其作為定量物質時發現，NIST11 檢索庫中無該物質信息。本工作在上述工作基礎上，在亞硝酸鹽的冷溶液中加入強酸，生成的亞硝酸與環己基氨基磺酸發生重氮化反應，期望利用其生成環己烯[13]對甜蜜素進行頂空-氣相色譜法定量分析。

2.2 色譜行為

將甜蜜素標準品和空白樣品按試驗方法進行氣相色譜測定，甜蜜素標準品衍生物的色譜圖見圖1，通過和空白樣品色譜圖比較得出，甜蜜素衍生產物的保留時間為1.73 min。取甜蜜素標準品衍生后溶液，在氣相色譜-質譜條件下進行分析，所得質譜圖見圖2。將該質譜圖與NIST11 譜庫比對，確定該衍生產物為環己烯，其保留時間為1.64 min。

圖1 甜蜜素衍生物的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of cyclamate derivative

圖2 甜蜜素衍生物的質譜圖Fig.2 Mass spectrum of cyclamate derivative

2.3 提取方法的選擇

試驗分別采用超聲、煮沸兩種方式對樣品進行了提取。超聲提取步驟見試驗方法;煮沸提取是將裝有樣品的比色管放入100℃水浴鍋中加熱1 h，其他步驟同超聲提取方法的一致。兩種方法的比對結果見表1。

由表1可知:超聲提取與煮沸提取結果無顯著差異，但得考慮前者的操作更便捷，試驗采用超聲提取方法。

2.4 頂空平衡條件的選擇

平衡時間的選擇，既要保證目標物質能從液相中充分逸散到氣相中，又要避免目標物質的分解和反應導致的目標產物含量降低。試驗選擇在50 ℃下 平 衡5，10，20，30，42，54，66，78，90，102，114，126，138，180，210，240，300 min后進樣，結果表明:環己烯峰面積隨著平衡時間的延長呈逐步下降趨勢，且100 min后峰面積已減小到原來的80%，為保證定量結果的準確性，應保證樣品在重氮化反應后100 min內完成測定。試驗選擇頂空平衡時間為30 min。

表1 超聲提取與煮沸提取結果對比(n＝6)Tab.1 Comparison of results obtained by ultrasonic extraction and boiling extraction(n＝6)

同時，當頂空進樣器和氣相色譜連續進樣50次以上未維護時，環己烯的峰形變差，響應值下降明顯。應在連續進樣30次后，將頂空進樣器的爐子、定量環和傳輸線在130 ℃老化1 h以上，將色譜柱在最高耐受溫度下老化0.5～1 h，以保證定量結果的重現性。

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

分別向5個頂空瓶中加入100 mg·L－1甜蜜素標準溶液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 m L，用水定容至10.0 m L，按試驗方法在色譜條件下進行測定。以甜蜜素標準品取樣量(mg)為橫坐標，以環己烯峰面積(μV·s－1)為縱坐標繪制標準曲線，甜蜜素標準品取樣量在0.000 01～5 mg內呈線性關系，線性回歸方程為y＝4.074×105x＋2.492×104，相關系數為0.999 9。

加入0.000 1 mg甜蜜素標準品，按試驗方法重復測定12次，以3倍信噪比計算方法檢出限(3S/N)為0.4 mg·kg－1，以10倍信噪比計算方法測定下限(10S/N)為1.3 mg·kg－1，而國家標準GB 5009.97－2016第一法中甜蜜素檢出限為10 mg·kg－1，本方法檢出限比國家標準方法的低。這是因為頂空法中環己烯主要集中在頂空瓶上方10 m L的空間，而定量閥體積為1.0 m L，相當于千分之一的環己烯進入氣相色譜儀;在國家標準GB 5009.97－2016第一法中，提取溶劑正己烷體積為10.0 m L，進樣量僅1.0μL，相當于萬分之一進入氣相色譜儀。因此，本法比國家標準方法檢出限低。除此之外，本方法還可以通過降低分流比進一步降低檢出限。

2.6 回收試驗

分別對雪碧樣品和雞蛋卷樣品進行3個濃度水平的6次平行加標回收試驗，計算回收率，結果見表2。回收率符合國家標準GB/T 27404－2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢驗》附錄F要求。

表2 本方法與國家標準方法回收率比對(n＝6)Tab.2 Comparison of recovery of this method and national standard method(n＝6)

2.7 方法比對

采用本方法和國家標準GB 5009.97－2016第一法分別對雞蛋卷等9種不同樣品進行分析，平行測定6次，結果見表3。兩種方法相對偏差的絕對值均小于4.0%，檢測結果無顯著差異。

表3 本方法與國家標準方法檢驗結果的對比(n＝6)Tab.3 Comparison of results of this method and national standard method(n＝6)

本工作采用頂空-氣相色譜-質譜法對甜蜜素衍生化產物進行定性，確定該衍生化產物為環己烯。并在國家標準GB 5009.97－2016第一法基礎上優化了前處理步驟，分析了甜蜜素衍生物峰面積與樣品平衡時間的關系曲線，得到樣品的最優平衡時間為30 min。建立了頂空-氣相色譜法測定食品中甜蜜素含量的方法。本方法的檢出限和回收率均符合國家標準GB/T 27404－2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢驗》附錄F要求。