應用頂空-氣相離子遷移譜分析百合發酵乳的風味物質

袁志鷹，黃惠勇，謝夢洲，周小江，李 亮，黃 培

(1.湖南中醫藥大學，長沙410208; 2.湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術研究中心，長沙410208;3.湖南省藥食同源功能性食品工程技術研究中心，長沙410208)

中藥百合屬于多年生草本植物[1-2]，為我國常用的藥、食兩用大宗中藥材，常以鱗莖和珠芽作為藥、食兩用部位，始載于漢朝《神農本草經》，具有潤肺止咳和養心安神的功效[3]。湖南省龍山縣獨特的環境條件造就了龍山百合品質優良且產量高。長期以來，龍山百合的研究主要集中在植物資源、藥材質量控制和藥效成分等方面[4-8]，鮮有人對百合藥膳食品的開發進行研究。

發酵乳是利用牛奶在乳酸菌作用下發酵制成的產品[9]，可以通過添加果蔬、藥食同源中藥等賦予其特殊的風味、口感和營養價值[10-11]。百合發酵乳是利用鮮百合和牛奶在乳酸菌作用下發酵制成的產品，因百合具有特殊的清香，百合酸奶風味獨特[12]。另外，中藥百合養心安神的功效賦予了百合發酵乳獨特的保健價值。風味是發酵乳品質的重要特征，揮發性風味物質的研究有助于定義保健發酵乳的品質，并可以評估發酵乳在發酵過程中的變化，加強發酵乳質量控制。由于發酵乳基質的復雜性，采用常見的分析方法研究發酵乳食品中的風味物質在提取、分離和定量方面具有一定的難度[13-14]。近年來，氣相離子遷移譜(GC-IMS)在分析食品中的風味物質研究中取得了突破，該技術具有無損綠色，快速簡便的優勢[15-17]。

本工作建立了頂空-GC-IMS(HS-GC-IMS)測定龍山百合原料及其保健發酵乳中風味物質的含量，并通過指紋圖譜結合正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)方法分析不同樣本間的特征標志物和差異性，以期對龍山特色百合資源產品的深度開發提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Flavour Spec?型氣相離子遷移譜儀;DL-4005型全自動發酵機;Philips SCF870120型全自動食品蒸制攪拌儀;Millipore型純水儀;AR124CN 型電子天平。

百合樣品采自湖南省龍山縣，經湖南中醫藥大學藥學院周小江教授鑒定為卷丹百合的新鮮肉質鱗莖;牛奶為某品牌純牛奶;雙歧桿菌酸奶發酵劑購自于某公司。

1.2 儀器工作條件

1)頂空條件 頂空進樣體積為500μL;孵育時間為10 min;孵育溫度為45 ℃;進樣針溫度為50 ℃。

2)GC-IMS 條 件 FS-SE-54-CB-1 色 譜 柱(15 m×0.53 mm，1μm);柱溫為40 ℃，IMS溫度為45 ℃;漂移氣(E1)和載氣(E2)均為氮氣，純度為99.999%。色譜洗脫程序:0～15 min時，E1的流量為150 m L·min－1;0～2 min 時，E2的流量為2 m L·min－1;2～10 min時，E2的流量由2 m L·min－1增大至100 m L·min－1;10～15 min 時，E2的流量由100 m L·min－1增大至150 m L·min－1。

1.3 試驗方法

1.3.1 百合原料制備工藝

將采集的百合新鮮鱗莖洗凈，將其剝成單瓣，將百合鱗莖放入全自動食品蒸制攪拌儀中，加入適量的水，設置為蒸制6 min，打漿30 s，得到細膩的勻漿狀蒸制百合(樣品代碼ZBH)，去其生腥味。

1.3.2 百合發酵酸奶制備工藝

取純牛奶100 m L，殺菌(90 ℃，5 min)，冷卻至室溫，加入0.1 g的雙歧桿菌酸奶發酵劑接種，設置發酵時間12 h，即得原味酸奶(樣品代碼SN-1/2)。另取純牛奶100 m L，按上述操作，發酵完成后，加入1.0 g勻漿狀蒸制百合，均質，即得百合酸奶(樣品代碼SN-3/4)。同時另取純牛奶100 m L 五份，如上操作，但設置發酵時間分別為8，10，12，14，16 h，即得不同發酵時間的百合發酵酸奶(樣品代碼BHSN)，每個樣品平行制備2份，共16批次樣品，具體樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of the samples

1.3.3 樣品的前處理

分別取1.0 g蒸制百合、百合發酵酸奶、百合酸奶及原味酸奶樣品置于20 m L頂空樣品瓶中，45℃平衡孵育10 min，將注射器加熱至80℃，將100μL樣品頂空自動注入GC-IMS中，15 min后得到樣品的揮發性組分信息。

1.3.4 數據處理

利用工作站Laboratory Analytical Viewer，Reporter，Gallery Plot，Simca PCA 以及GC-IMS Library Search查看分析譜圖，自動檢索各組分NIST數據庫和IMS數據，對物質進行定性分析，并生成指紋圖譜對比，對樣品進行風味物質的OPLS-DA。

2 結果與討論

2.1 GC-IMS檢測結果

蒸制百合、百合發酵酸奶、百合酸奶、原味酸奶的揮發性風味物質的檢測結果見圖1。通過檢索NIST 數據庫和IMS 數據，蒸制百合、百合發酵酸奶、百合酸奶、原味酸奶的風味物質包括二聚體共鑒定出24種化合物以及其遷移時間，詳見表2。

2.2 蒸制百合、百合酸奶和百合發酵酸奶風味物質的指紋圖譜分析

由圖1可以看出，蒸制百合中風味物質最少，百合發酵酸奶中風味物質最多，而百合酸奶與百合發酵酸奶揮發性物質非常相似。為對比不同樣品間揮發性有機物的差異(百合發酵酸奶取發酵時間為12 h的發酵樣品)，采用LAV 軟件的Gallery Plot功能，選取離子遷移圖中所有的待分析區域，生成指紋圖譜。結果表明:正己醇等物質在蒸制百合樣品中的含量較多，在其他樣品中含量非常少，可以將其視為蒸制百合的特征揮發性有機物;乙酸乙酯二聚體、3-甲基-1-丁醇和2-甲基丁酸甲酯等揮發性有機物在百合酸奶、百合發酵酸奶以及蒸制百合中含量較高，且在原味酸奶中含量最低，故可推測百合酸奶及百合發酵酸奶中該類物質主要來源于蒸制百合樣品;丁二酮、正丙醇等揮發性物質在蒸制百合和原味酸奶中含量均較高，但在百合酸奶及百合發酵酸奶中含量均降低;2-戊酮、2-庚酮、正丁醇及其二聚體、2-戊酮及其二聚體等物質在原味酸奶中含量最高，且在蒸制百合中含量很低，可見百合酸奶及百合發酵酸奶中此部分揮發性有機物主要來源于原味酸奶;正己醛二聚體、丙酸乙酯及其二聚體、3-甲基-1-丁醇、1-戊醇和2-己酮等物質在蒸制百合及原味酸奶中含量很少，而百合酸奶和百合發酵酸奶中則含量較高，這類物質可以作為百合酸奶、百合發酵酸奶區別于原味酸奶和蒸制百合的標志物。從整體上分析，百合酸奶與百合發酵酸奶的揮發性有機物非常相似。將鑒定得到的24種化合物的信號峰的峰強度進行進一步分析可得到這2種樣品中揮發性物質含量差異，結果見圖2。

圖1 樣品的氣相離子遷移譜圖Fig.1 GC-IMS spectra of the samples

表2 24種風味物質的鑒定信息Tab.2 Indentification information of 24 flavoring substances

圖2 樣品信號峰強度差異圖Fig.2 Differences of peak intensities of the samples

2.3 不同發酵時間的百合發酵酸奶風味物質分析

為對比不同發酵時間的百合發酵酸奶風味物質的差異，采用LAV 軟件的Gallery Plot功能，選取離子遷移圖中所有的待分析區域，生成指紋圖譜。將不同發酵時間樣品鑒定得到的24種化合物的信號峰的峰強度進行差異分析可得圖3。

結果表明:不同的風味物質含量具有明顯差異;乙酸乙酯二聚體、2，3-戊二酮二聚體、正丙醇等3種成分的含量在不同發酵時間的百合發酵酸奶中都較高，而正丁醇二聚體含量在發酵8 h時最高，且隨著發酵時間的延長而減少;正丙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁酸甲酯等揮發性風味物質在不同發酵時間的樣本中的含量變化比較穩定。

圖3 不同發酵時間樣本信號峰強度差異圖Fig.3 Differences of peak intensities of samples with different time of fermentation

2.4 樣品的正交偏最小二乘法判別分析

對樣品風味物質進行OPLS-DA，結果見圖4。

百合酸奶與百合發酵酸奶的樣品間呈聚集狀，而蒸制百合、原味酸奶樣品間呈離散狀態，樣品內部點均呈聚集狀。OPLS-DA 圖可以準確區分蒸制百合、原味酸奶、百合酸奶、百合發酵酸奶。4組樣品間，百合酸奶和百合發酵酸奶相似度最大，而原味酸奶與百合酸奶、百合發酵酸奶的相似度遠大于蒸百合，即百合酸奶、百合發酵酸奶中揮發性成分主要來源于原味酸奶。由圖5的不同發酵時間的百合發酵酸奶的OPLS-DA 圖分析可知，根據揮發性風味物質的類似性，5個不同發酵時間的樣本，可分為8 h、10 h和12 h、14 h和16 h等3組。2個主要的風味揮發性有機物成分(乙酸乙酯二聚體、2，3-戊二酮二聚體)在12 h的發酵時間中含量均較高，2，3-戊二酮具有奶油、焦糖香氣，并帶有堅果底香，而低含量的乙酸乙酯具有清靈、微帶果香的酒香。因此，通過指紋譜圖及OPLS-DA 判斷12 h的發酵時間相對于其他發酵時間更優。

圖4 百合、百合酸奶、百合發酵酸奶風味物質OPLS-DA 分析Fig.4 OPLS-DA analysis of flavoring substances in lily，lily yoghurt and lily fermented yoghurt

圖5 不同發酵時間的百合發酵酸奶風味物質OPLS-DA 分析Fig.5 OPLS-DA analysis of flavoring substances in lily fermented yoghurt with different fermentation time

風味是發酵乳食品生產者和消費者關注的熱點，風味揮發物質是發酵乳品質的重要特征。本工作采用HS-GC-IMS技術共鑒定出24種揮發性物質。通過HS-GC-IMS指紋圖譜差異性分析，得到了15種特征性標志物，如丙酸乙酯二聚體、2-己酮等，通過這些特征標志物可以作為判斷百合酸奶和原味酸奶的差異標志物，并且發現正丁醇二聚體可以作為判斷百合發酵乳不同發酵時間的指示劑。結合指紋圖譜和OPLS-DA 分析，HS-GC-IMS技術可以很好的區分百合、百合發酵酸奶與原味酸奶，并可以對發酵時間與品質的關聯性提供技術指導。因此，基于HS-GC-IMS的百合發酵乳的風味研究有助于定義百合保健發酵乳的品質，并可以評估發酵乳發酵過程中的風味物質動態變化，對加強百合發酵乳質量控制，深度開發湖南特色百合資源具有重要現實意義。