固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法測定助眠類保健品中22種禁用安神類藥物的含量

鐘世歡，金建奇，葉磊海，，葉佳明，王 瀟，裘鈞陶

(1.贊宇科技集團股份有限公司，杭州310009; 2.浙江金正檢測有限公司，義烏321000;3.浙江公正檢驗中心有限公司，杭州310009)

失眠是一種常見的睡眠障礙癥，患者常常因睡眠時間、質量不滿足而影響日間社會功能。長期失眠會導致工作效率降低，社會成本增加[1]，甚至引發心臟病、高血壓等心腦血管疾病[2-4]，對人類的生理和心理產生極大的傷害。部分失眠患者為緩解失眠癥狀，會選擇助眠類保健品進行輔助治療，認為其具有效果溫和、不良反應小等優點。但個別不法商家為了牟取暴利，將禁用安神類藥物添加至保健品中，以增強藥效。這些非法添加的化學藥物使患者產生依賴性，大量使用會引發相應的毒副作用，抑制患者的中樞神經[5]，影響其認知能力[6]。在患者不知情下使用，容易引發和其他物質相互作用[7]，甚至中毒，嚴重危害患者生命安全。因此，國家對禁用安神類藥物的添加量進行了嚴格的規定，在保健品中禁止添加。

目前，國家食品藥品監督管理局在“藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件(2009024、2013002和2012004)”中提出了禁用安神類藥物的測定方法，包括薄層色譜法和液相色譜法，該方法涉及色譜體系較多，分析時間長，樣品的提取過程較繁瑣，無法同時快速測定多種禁用安神類藥物的含量。國內外報道的關于禁用安神類藥物的測定方法主要有高效液相色譜法[8]、數字對照品法[9]、薄層色譜法[10]、高效液相色譜-串聯質譜法[11-14]及氣相色譜-串聯質譜法[15]等，但是同時測定保健品中22種禁用安神類藥物的分析方法較少。

本工作建立了超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)同時測定助眠類保健品中22種禁用安神類藥物的含量，該方法具有快速、準確和簡便等優點，可用于指導實際工作，可為助眠類保健品的風險評估提供技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

AB 4500型超高效液相色譜-串聯質譜儀，配電噴霧離子源和Analyst數據處理系統;AR 2140型電子分析天平;KS-300EI型超聲波清洗器;Centrifug-5804R 型臺式離心機;N-EVAP 11 型氮吹儀;Milli-Q 型純水儀;Oasis PRi ME HLB固相萃取柱(200 mg/6 m L)。

22 種禁用安神類藥物的單標準儲備溶液:1 000 mg·L－1，分別稱取各禁用安神類藥物標準品0.010 0 g，用甲醇溶解并轉移至10 m L棕色容量瓶中，用甲醇定容，于－20 ℃下避光保存。

22 種禁用安神類藥物標準品，純度均大于98%;乙腈、甲酸和甲醇均為色譜純;試驗用水為超純水。

試驗選擇的助眠類保健品均由流通市場上隨機抽樣得到。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm);流量為0.30 m L·min－1;進樣量2.0μL;柱溫35 ℃;流動相A 為含0.05%(體積分數，下同)甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min時，B為5%;0.5～5.0 min時，B 由5%升至90%;5.1～9.0 min時，B為90%;9.1～12.0 min時，B為5%。

2)質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子(ESI＋)和負離子(ESI－)掃描模式同時采集;多反應監測模式;離子源溫度500 ℃;氣簾氣壓力278.5 k Pa，噴霧氣壓力69.0 k Pa，輔助加熱氣壓力379.2 k Pa。22 種禁用安神類藥物的質譜參數見表1，其中“?”為定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取樣品1.000 g，用甲醇溶解并轉移至25 m L容量瓶中，渦旋混勻，超聲15 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，混合搖勻，離心，取上清液5.00 m L經過Oasis PRi ME HLB 固相萃取柱，收集流出液，用甲醇2 m L淋洗固相萃取柱2次，合并收集的流出液，于40 ℃下吹氮濃縮至近干，再用體積比為1∶1的0.05%甲酸-甲醇混合溶液1.00 m L重復溶解殘渣，經過0.22μm 濾膜過濾，得到的濾液按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

2.1.1 提取劑

部分不法廠商將禁用藥物摻雜在片劑包衣或膠囊殼中，以逃避抽查檢測，試驗將樣品連同片劑包衣和膠囊殼一起研碎后取樣。22種禁用安神類藥物的物理、化學性質不同，試驗考察了分別以甲醇、乙醇和乙腈為提取劑時，對膠囊類、口服液類、片劑類保健品中22 種禁用安神類藥物提取效率的影響。結果表明:甲醇、乙醇和乙腈提取劑對口服液類保健品中22種禁用安神類藥物的提取效率相當;膠囊類和片劑類保健品富含天然產物、蛋白質與脂肪類化合物，用乙醇提取時，基質干擾物較多，受基質抑制效應的影響嚴重，而用甲醇、乙腈提取膠囊類保健品和片劑類保健品時基質影響較乙醇小。考慮到甲醇比乙腈更安全經濟，試驗選擇的提取劑為甲醇。

2.1.2 固相萃取柱

為了進一步減小基質干擾，試驗比較了C18固相萃取柱、DisQu E凈化粉及Oasis PRi ME HLB固相萃取柱對22種禁用安神類藥物的凈化效果，結果見圖1。

圖1 不同種類的固相萃取柱對22種禁用安神類藥物凈化效率的比較Fig.1 Comparison of efficiency of purification of the 22 forbidden sedative-hypnotics by different kinds of solid phase extraction columns

由圖1可知:Oasis PRi ME HLB固相萃取柱對22種禁用安神類藥物的凈化效果最好，可有效降低基質效應。試驗選擇Oasis PRi ME HLB固相萃取柱對樣品進行凈化。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱

試驗考察了Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm)和RSLC 120 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.2μm)對22種禁用安神類藥物測定的影響。結果表明:這2種色譜柱對22種禁用安神類藥物的分離效果相當，且在基線噪聲方面沒有太大差別，但Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm)的系統壓力較小，試驗選 擇Poroshell 120 EC-C18色 譜 柱(50 mm ×3.0 mm，2.7μm)對22 種 禁 用 安 神 類 藥 物 進 行分離。

2.2.2 流動相

試驗考察了分別以0.1%甲酸溶液、含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液為流動相A 時對22種禁用安神類藥物分離效果的影響。結果表明:流動相中加入甲酸溶液可增加離子化效率，使信號響應強度增強;乙酸銨調節流動相的酸度且具有緩沖作用，可防止色譜峰出現拖尾現象，有效改善峰形，其中對巴比妥類禁用安神類藥物的出峰情況改善最為明顯。試驗選擇的流動相A 為含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液。以含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液為流動相A 時，巴比妥類禁用安神類藥物的總離子流色譜圖見圖2。

試驗進一步考察了分別以乙腈、甲醇為流動相B對22種禁用安神類藥物測定的影響。結果發現:以甲醇為流動相B時，22種禁用安神類藥物的峰形扁平甚至分叉，且分離度較差;以乙腈為流動相B時，基線平穩且22種禁用安神類藥物的峰形良好。綜合考慮，試驗選擇的流動相為含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液-乙腈混合溶液。

圖2 4種禁用安神類藥物的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of 4 forbidden sedative-hypnotics

2.3 質譜條件的選擇

配制5 mg·L－1的22種禁用安神類藥物的標準溶液，用針泵取樣后，在手動調節模式下，通過針泵以10μL·min－1的流量進樣來確定母離子;再通過手動調節去簇電壓值，使母離子的信號強度只有最強碎片離子信號強度的三分之一左右，選擇兩個最強的碎片離子作為子離子;再優化碰撞電壓，提供離子共振能量，有效防止溶劑分子吸附從而實現去簇，同時預防離子共振碎裂導致源內裂解;最后對離子源溫度、氣簾氣壓力、噴霧氣壓力和輔助加熱氣壓力等參數進行優化，使目標物的響應信號達到較大。在ESI＋模式下18 種禁用安神類藥物的色譜圖見圖3，在ESI－模式下4種巴比妥類禁用安神類藥物的色譜圖見圖2。

圖3 18種禁用安神類藥物的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion flow chromatogram of 18 forbidden sedative-hypnotics

在巴比妥類禁用安神類藥物的質譜條件優化時，發現均有質荷比(m/z)為85 碎片離子，根據4種巴比妥類化合物結構式及碎片信息推測，其斷裂方式見圖4。

圖4 禁用安神類藥物的裂解方式Fig.4 The cracking mode of the forbidden sedative-hypnotics

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件對22種禁用安神類藥物的混合標準溶液系列進行測定，以22種禁用安神類藥物的質量濃度為橫坐標，與其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。22種禁用安神類藥物的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。

表2 線性參數、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表2(續)

以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結果見表2。

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白膠囊類、片劑類和口服液類保健品樣品進行加標回收試驗，加標量為3，10，100倍的檢出限，每個加標樣品平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結果表明:22 種禁用安神類藥物的回收率為81.2%～98.9%，RSD 為3.1%～9.7%。

2.6 樣品分析

按照試驗方法對市場上流通銷售的膠囊類、片劑類和口服液類等30 種助眠類保健品進行測定。結果表明:有1種樣品中檢出褪黑素，質量分數為2.10 mg·g－1。國家標準GB/T 5009.170－2003中關于保健品中褪黑素的測定方法為高效液相色譜-紫外檢測法，采用該方法對該陽性樣品進行測定，褪黑素的質量分數為2.15 mg·g－1，說明本工作建立的方法準確可行。

本工作建立了UPLC-MS/MS同時測定助眠類保健品中22種禁用安神藥物的分析方法。優化了前處理方法和儀器工作條件，減少了前處理時間及成本，避免了復雜前處理過程導致的目標物損失。該方法具有快速、靈敏度高、專屬性強等優點。針對目前助眠類保健品種類繁多，市場情況復雜的情況，可用于實際檢測工作，實現樣品中各種禁用安神類藥物的快速分析篩查，可為助眠類保健品安全突發事件的快速處理工作提供技術支持。