反相高效液相色譜法結合計時波長切換紫外檢測法測定苯妥英及其中間體的含量

朱愛齡，倪貌貌，宋亞萍，譚志文，俞 超，汪財生，張凱龍

(浙江萬里學院 生物與環境學院，寧波315100)

苯妥英鈉，又名大侖丁鈉，化學名為5，5-二苯基-2，4-咪唑烷二酮鈉鹽，是乙內酰脲類抗癲癇藥物，常用于抗心律失常、抗三叉神經痛和抗輕度高血壓等[1]，由前體苯妥英(Ⅲ)與對應的化學計量比的氫氧化鈉成鹽制得[2]。前體苯妥英的合成過程是一個多步反應，先由苯甲醛縮合合成安息香(Ⅰ)，經氧化生成苯偶酰(Ⅱ)，再與尿素縮合得到，具體流程見圖1。

安息香氧化是制備苯偶酰的主要方式，也是苯妥英合成的關鍵步驟，傳統一次性計量氧化劑消耗量大、污染嚴重[3-5]，隨著近年來綠色化學和循環經濟的興起，各類綠色氧化劑如過氧化氫、臭氧、氧氣、空氣引起了關注。在催化空氣氧化反應領域，安息香氧化已被作為模式反應廣泛用于催化劑性能的評價[6-9]。

圖1 安息香氧化制備苯偶酰及苯妥英Fig.1 Preparation of benzil and phenytoin by oxidation of benzoin

在苯妥英制備過程中，需要對苯妥英純度及低濃度苯偶酰、安息香等殘留量進行測定。本工作建立了反相高效液相色譜法結合計時波長切換紫外檢測法同時測定苯妥英及其中間體苯偶酰、安息香的含量，方法簡單快捷、靈敏高效，可為苯妥英制備方法開發及相關產品檢測提供技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1201型高效液相色譜儀，配UV 1201 型紫外檢測器、P 1201型二元高壓泵;UV 2600型紫外-可見分光光度計;Milli-Q Integral 5 型超純水系統;ME104E型分析天平。

安息香、苯偶酰和苯妥英的單標準儲備溶液:1 000 mg·L－1，分別稱取安息香、苯偶酰和苯妥英100 mg，用乙腈溶解定容至100.0 m L，于4 ℃冷藏備用。使用時用乙腈稀釋至所需質量濃度。

安息香(純度不小于99.5%)、苯偶酰(純度不小于98%)和苯妥英(純度不小于99%)等標準品;甲醇和乙腈均為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

kromasil 100-5C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5μm);進樣量20μL;柱溫30 ℃;流動相為體積比為80∶20 的乙腈-水溶液;等度洗脫，流量為1.0 m L·min－1。計時波長切換程序:0～3.0 min時，檢測波長為218 nm;3.0～4.0 min時，檢測波長為247 nm;4.0～6.0 min時，檢測波長為260 nm;根據保留時間定性，峰面積外標法定量。

1.3 試驗方法

以鹽酸酸化的二甲亞砜為溶劑，鐵鹽催化空氣氧化安息香制備苯偶酰，苯偶酰與尿素縮合制備苯妥英。稱取100 mg合成樣品，用乙腈溶解并定容至100.0 m L，稀釋50倍后，經過0.45μm 濾膜過濾，得到濾液，按照儀器工作條件進行測定，同時進行雜質含量分析。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對安息香、苯偶酰和苯妥英的混合標準溶液進行測定，色譜圖見圖2。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測波長

以乙腈為參比，用紫外-可見分光光度計在200～400 nm 內對安息香、苯偶酰和苯妥英進行掃描，結果見圖3。

由圖3可知:苯偶酰、安息香和苯妥英的最大吸收波長分別為260，247，218 nm，安息香和苯偶酰的最大吸收波長比較接近，但與苯妥英的最大吸收波長相差較遠，三者在205 nm 處均具有較強吸收，同

圖2 混合標準溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution

圖3 苯偶酰、安息香和苯妥英的紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectra of benzil，benzoin and phenytoin

時流動相在該波長下吸收也較強，雜質干擾也較多，并且低波段光源穩定性低，基線漂移較大。綜合考慮，采用計時波長切換紫外檢測法不僅可以測定產物主成分含量，而且可以兼顧低含量的殘留雜質的高靈敏度檢測[10-14]。

2.2.2 流動相的組成及其流量

試驗考察了分別以甲醇-水溶液和乙腈-水溶液為流動相進行等度洗脫時，對苯妥英、安息香和苯偶酰分離效果的影響。結果表明:以甲醇-水溶液為流動相時，分析時間較長，且色譜圖存在拖尾現象;以乙腈-水溶液為流動相時，色譜峰的峰形良好，且分析時間顯著縮短。試驗選擇的流動相為乙腈-水溶液。

試驗進一步考察了分別以體積比為60∶40的乙腈-水溶液、體積比為70∶30的乙腈-水溶液和體積比為80∶20的乙腈-水溶液為流動相時，對苯妥英、安息香、苯偶酰分離效果的影響，結果見圖4。

圖4 不同組成的流動相條件下混合標準溶液的色譜圖Fig.4 Chromatograms of mixed standard solution with different mixing ratios mobile phases

由圖4可知:當流動相中乙腈比例較低時，流動相的洗脫能力較弱，各物質的色譜峰保留時間較長，且以體積比為60∶40的乙腈-水溶液為流動相時，色譜峰出現一定程度的拓寬和變形;隨著流動相中乙腈比例的增大，各物質的色譜峰保留時間減少，當以體積比為80∶20的乙腈-水溶液為流動相時，苯妥英、安息香、苯偶酰的相鄰色譜峰分離度分別為1.88，3.95，均大于1.5，實現了三組分的完全分離。試驗選擇的流動相為體積比為80∶20 的乙腈-水溶液。

試驗進一步考察了流動相為體積比為80∶20的乙腈-水溶液的流量分別為0.8，1.0，1.2 m L·min－1時，對苯妥英、安息香和苯偶酰分離效果的影響，結果見圖5。

圖5 體積比為80∶20的乙腈-水溶液在不同流量條件下混合標準溶液的色譜圖Fig.5 Chromatograms of mixed standard solution with different flow rates of acetonitrile-water solution with the volume ratio of 80∶20

由圖5可知:當流動相為體積比為80∶20的乙腈-水溶液的流量為0.8 m L·min－1時，苯妥英、安息香和苯偶酰可實現完全分離，但分析時間較長;當流動相為體積比80∶20 的乙腈-水溶液的流量為1.2 m L·min－1時，苯妥英和安息香的色譜峰較為接近，不利于較高濃度的苯妥英和安息香的完全分離。綜合考慮，試驗選擇流動相為體積比為80∶20的乙腈-水溶液的流量為1.0 m L·min－1。

2.3 標準曲線、檢出限和測定下限

用乙腈將安息香、苯偶酰和苯妥英的混合標準溶 液 稀 釋 為0.1，0.5，1，5，10，20，40，60，80，100 mg·L－1的混合標準溶液系列，按照儀器工作條件對其測定。以安息香、苯偶酰和苯妥英的質量濃度為橫坐標，與其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。安息香、苯偶酰和苯妥英的質量濃度均在0.1～100 mg·L－1內與其對應的峰面積之間呈線性關系，線性回歸方程和相關系數見表1。

以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結果見表1。

表1 線性參數、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收試驗

對實際樣品進行低、中、高等3種水平的加標回收試驗，每個加標樣品平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知:安息香的回收率為98.0%～99.0%，RSD 為2.0%～4.2%;苯偶酰的回收率為97.2%～105%，RSD 為2.3%～2.7%;苯妥英的回收率為95.4%～99.5%，RSD 為1.8%～2.1%。回收率高，方法準確，可滿足分析要求。

本工作建立了反相高效液相色譜法結合計時波長切換紫外檢測法測定安息香、苯偶酰和苯妥英含量的分析方法。方法分析快速、靈敏度高、重現性好，適用于催化氧化安息香模式反應研究，可適用于苯偶酰及苯妥英生產制備過程中的測定及殘留量分析。