沒食子酸對心肌梗死后心肌纖維化作用及機制

樸哲浩，王天嬌，金 麗，崔 燕

(1．溫州醫科大學附屬第二醫院 心血管內科，浙江 溫州325000；2．中國醫學科學院阜外醫院深圳醫院 心血管內科；3.吉林大學第二醫院 心血管內科)

心肌梗死是臨床上常見的急危重癥，嚴重影響患者的壽命和生存質量。心肌纖維化是心肌梗死后主要的病理過程，可致心功能障礙、心律失常甚至猝死[1]。因此，有效預防、抑制和逆轉心肌纖維化，對提高心肌梗死患者的生存率及改善預后起著重要的作用。然而，目前對于心肌梗死后心肌纖維化的具體機制尚不完全清楚，故缺乏有效的干預措施。既往研究表明，組蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase，HDACs)在心血管系統中起著重要作用，對心肌纖維化亦有調控作用[2-5]。本研究通過建立心肌梗死小鼠模型，探討組蛋白去乙酰化酶在心肌纖維化中的作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

選擇8周齡SPF級CD-1雄性小鼠40只，體質量35-40 g。細胞實驗：H9C2細胞株(韓國全南大學醫院實驗室提供)。

1.2 試劑和儀器

沒食子酸(G7384)購自美國Sigma公司。心臟組織的總RNA分離試劑盒、TOP script RT Dry MIX 、SYBR Green PCR試劑盒。ANP鼠單克隆抗體、BNP 鼠單克隆抗體、Collagen Ⅰ鼠單克隆抗體、Fibronectin鼠單克隆抗體、MMP9鼠單克隆抗體、HDAC5鼠單克隆抗體；Masson 三色染色試劑盒，美國ABI 7500熒光定量PCR儀；微板紫外連續波長酶標儀；蛋白電泳儀(韓國全南大學醫院實驗室提供)。

1.3 方法

1.3.1動物造模、H9C2細胞實驗分組及給藥 ① 小鼠適應性飼養1 w后，所有小鼠腹腔注射50 mg/kg 的戊巴比妥鈉進行麻醉，仰臥位固定于鼠板，行氣管插管，連接小動物呼吸機，左心耳下方2 mm處結扎左冠狀動脈前降支制備心肌梗死模型。其中，隨機選取10只作為假手術組，假手術組只穿線不結扎。關閉胸腔，縫合，小鼠有自主呼吸后，關閉呼吸機，拔出氣管。再將造模成功后的20只小鼠隨機分為心肌梗死模型組及沒食子酸干預組，各組10只。沒食子酸干預組給予沒食子酸(100 mg/kg/d) 腹腔注射，假手術組和心肌梗死模型組腹腔注射等體積生理鹽水。連續給藥2 W。② 將H9C2 細胞株置于正常培養箱中培養，選擇對數生長期細胞，用胰酶細胞消化液制成細胞懸液，后將細胞接種到12孔板中，并分為：正常對照組、HDAC5過表達組、沒食子酸干預組。正常對照組未轉染任何質粒，過表達組為HDAC5質粒轉染，沒食子酸干預組經HDAC5質粒轉染并給予沒食子酸(藥物濃度100 μM)。

1.3.2心功能指標檢測 2 W 藥物干預結束后，小鼠經50 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，使用Vivid S5型小動物超聲繪制小鼠二維超聲心動圖進行心臟超聲檢測，獲得各組M型超聲心動圖，記錄小鼠左室收縮末內徑(LVESD)和舒張末期內徑(LVEDD),并計算左室短軸縮短分數(LVFS%)=(LVEDD-LVESD)×100/LVEDD。

1.3.3Western blotting檢測心肌組織ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、HDAC4,HDAC5、HDAC7、HDAC9、MMP9、GAPDH 蛋白表達 80 mg心肌組織中加入500 μl細胞裂解液(20 mmol/L Tris pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% Nonidet P-40，0.5% Sodium Deoxycholate，1 mmol/L EDTA，0.1% SDS，用前加 100 μg/mL PMSF)，充分勻漿后置于冰上裂解30 min。12 000×g 離心10 min，收集上清，加入5×SDS Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。SDS-PAGE電泳，轉膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入封閉液稀釋的ANP(1∶1 000)、BNP(1∶1 000)、Collagen Ⅰ(1∶1 000)、Fibronectin (1∶1 000)、HDAC4 (1∶1 000)、 HDAC5(1∶1 000)、 HDAC7 (1∶1 000)、 HDAC9 (1∶1 000)、 MMP9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜。PBST 洗滌3 次，加入HRP標記的IgG二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌3 次，ECL顯影。

1.3.4RT-PCR檢測 采用H9C2細胞總RNA提取試劑盒提取H9C2細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA提取質量。采用RNA逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。設計熒光定量PCR引物分別為：HDAC5 F:AGCACCTCTTCACCACAGGT R:GTCCCATAGAGCAGGGTGTG MMP9 F:GAAGGCAAACCCTGTGTGTT R:AGGAAGA-CGAAGGGGAAGAC GAPDH F:GCATGGCCTTCCGTGTTCCT R:CCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCAT 據熒光定量PCR試劑盒說明配制反應體系，設置熒光定量 PCR 反應程序為：95 ℃變性，30 s；58 ℃ 退火30 s；72 ℃延伸30 s，39 個循環，制作溶解曲線。反應結束后從儀器上讀取MMP9 mRNA相對表達水平。

1.3.5Masson’s 染色檢測心肌膠原含量 心肌組織用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片，常規脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染色7 min，酸性乙醇分化10 s，蒸餾水沖洗。Masson藍化液返藍3 min，蒸餾水沖洗。麗春紅品紅染色8 min，弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min。苯胺藍染色2 min，弱酸工作液洗1 min。95%乙醇快速脫水20 s，無水乙醇脫水3 次，每次20-30 s。二甲苯透明3 次，每次2 min。光學顯微鏡下隨機選擇5個視野，使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析心肌纖維化程度。膠原容積分數(CVF)= 膠原纖維染色面積/組織切片總面積。

2 結果

2.1 沒食子酸對心肌梗死小鼠心功能指標的影響

沒食子酸明顯改善心肌梗死后受損的心臟功能。結果如圖1 所示，與假手術組比較，心肌梗死模型組小鼠LVEDD、LVESD顯著升高，LVFS則顯著降低(P<0.001)。而沒食子酸干預組與心肌梗死組比較，沒食子酸干預組小鼠LVEDD、LVESD顯著降低，LVFS顯著升高(P<0.001)。

圖1 超聲心動圖觀察心肌梗死后心功能

2.2 沒食子酸對心肌梗死小鼠心肌組織膠原含量的影響

沒食子酸對心肌梗死后心肌纖維化有明顯抑制作用。結果如圖2 所示，假手術組小鼠細胞排列規整，少量膠原纖維(藍色)散在分布；心肌梗死模型組小鼠有大量膠原纖維增生且分布雜亂；沒食子酸干預組膠原纖維增生程度較心肌梗死模型組明顯降低。心肌梗死模型組小鼠心肌組織CVF 顯著高于假手術組， 沒食子酸干預組較心肌梗死模型組CVF顯著降低，差異有統計學意義(P<0.001)。

圖2 Masson 染色觀察心肌膠原含量

2.3 沒食子酸對心肌梗死小鼠心衰標記物、心肌纖維化標記物、組蛋白去乙酰化酶、基質金屬蛋白酶表達的影響

沒食子酸降低心肌梗死后心力衰竭標記物及纖維化標記物基因的表達。結果如圖 3所示，與假手術組比較，心肌梗死模型組心肌組織ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、HDAC5、MMP9 蛋白表達均顯著升高。而沒食子酸干預組與心肌梗死模型組比較，沒食子酸干預組心肌組織ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、 HDAC5、MMP9蛋白表達顯著降低。

2.4 沒食子酸對過表達HDAC5心肌細胞中MMP9蛋白及mRNA表達的影響

結果如圖4 所示,與正常對照組比較，HDAC5過表達組MMP9蛋白及mRNA均顯著升高。而沒食子酸干預組與HDAC5過表達組比較，沒食子酸干預組MMP9蛋白及mRNA均顯著降低(P<0.001)。

圖3 檢測心肌組織心力衰竭標記物、纖維化標記物、HDAC、MMP蛋白表達水平

圖4 檢測HDAC5過表達時MMP9蛋白及m RNA 變化

3 討論

雖然介入、藥物等治療手段已在冠心病患者中廣泛應用，但目前我國心肌梗死的發病率及死亡率仍呈逐年上升趨勢[6]。心肌梗死發生后，心肌細胞缺血缺氧、神經-體液等因素異常激活，引起心室負荷過重、心室重構，所致心肌梗死后的心力衰竭是造成病死率居高不下的一個重要原因。心肌纖維化是心肌梗死后心室重構的主要病理基礎，研究表明，多種細胞因子參與了該過程，包括：炎癥反應、細胞凋亡、細胞信號調節等[7]，但具體的病理生理機制目前仍不明確。而沒食子酸的出現為解決上述問題提供了新的思路。

沒食子酸亦稱“五倍子酸”、“棓酸”，學名“3,4,5-三羥基苯甲酸”，分子式C7H6O5，廣泛存在于掌葉大黃、大葉桉、山茱萸等植物中，是自然界存在的一種多酚類化合物。既往研究顯示沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學活性[8]，研究中亦發現沒食子酸可顯著改善肺纖維化[9]。本研究通過比較沒食子酸給藥前后心肌梗死小鼠的心功能參數、心肌組織病理形態變化及心肌纖維化相關指標的變化，探究沒食子酸在心肌梗死中對心肌纖維化的抑制作用，及其與HDAC5信號通路的關系。

眾所周知，心肌纖維化作為心臟功能減退的病理基礎，以成纖維細胞增殖、膠原累積或細胞外基質沉積為特征，最終引發心力衰竭甚至死亡[10,11]。本研究結果顯示，與假手術組比較，心肌梗死模型組小鼠LVEDD 和LVESD 升高，LVFS降低，心肌膠原含量顯著升高，提示心肌梗死心功能受到嚴重影響。使用沒食子酸干預后，與心肌梗死模型組比較，小鼠LVEDD和LVESD 降低，LVFS升高，心肌膠原含量顯著減少，顯示心功能得到改善。另外，與假手術組比較，心肌梗死模型組小鼠心力衰竭及心肌纖維化標記物ANP,BNP,Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白水平明顯升高，沒食子酸干預后ANP,BNP,Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白水平較心肌梗死模型組明顯下降。以上結果顯示，沒食子酸對心肌梗死后心力衰竭、心肌纖維化有明顯改善作用。

既往的研究表明，組蛋白去乙?；?HDAC)在心肌纖維化中有著重要作用，18種HDAC家族成員各自作為壓力信號對纖維化進行調控[12-18]，同時，已明確基質金屬蛋白酶(MMPs) 作為心肌纖維化靶點影響心肌纖維化過程[19,20]。本研究顯示，與假手術組比較，心肌梗死模型組小鼠HDAC5、MMP9蛋白水平明顯升高，而沒食子酸干預組與心肌梗死模型組比較HDAC5、MMP9蛋白水平明顯降低。在心肌細胞實驗中，與正常對照組比較， HDAC5過表達組MMP9 蛋白及mRNA水平明顯升高，而沒食子酸干預組MMP9 蛋白及mRNA水平則較HDAC5過表達組顯著下降。

綜上所述，在心肌梗死心肌纖維化過程中，HDAC5表達水平明顯升高，而沒食子酸可通過HDAC5信號通路進而下調MMP9進一步抑制心肌纖維化，能夠為心肌梗死后心肌纖維化的藥物治療提供一定參考依據。