曲美他嗪對(duì)慢性心力衰竭大鼠的心腎保護(hù)作用及其機(jī)制探究

曾顯閣

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院 心臟大血管外科，河南 南陽(yáng)473009)

慢性心力衰竭(CHF)作為大多數(shù)心臟疾病的最終階段，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常伴有腎、肺等器官功能異常[1]。有研究表明，CHF合并腎功能異常會(huì)加重患者的病情，致其住院率以及死亡率上升，從而導(dǎo)致患者心腎功能進(jìn)一步惡化[2]。所以，保護(hù)患者腎功能是在治療CHF的同時(shí)不可忽視的一項(xiàng)重要工作。曲美他嗪可以提高患者心肌細(xì)胞功能，其能夠抑制脂肪酸氧化，阻止ATP水平下降，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[3]。本文旨在探討曲美他嗪對(duì)慢性心力衰竭(CHF)大鼠的心腎保護(hù)作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料鹽酸曲美他嗪片購(gòu)于施維雅制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H200554654；周齡雄性Wistar大鼠24只，體重210-250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；蘇木素染液、Masson染液試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，其他試劑購(gòu)于上海生工生物股份有限公司。

全自動(dòng)生化儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼有限公司；石蠟切片機(jī)購(gòu)于英國(guó)Shandon公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于瑞士Tecan公司；電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 CHF模型與分組將24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組8只、造模組16只。造模組大鼠均注射1.5 ml/kg戊巴比妥鈉(3%)進(jìn)行麻醉，在腹部正中間切口分層打開(kāi)腹部，在左腎上腹主動(dòng)脈分離出之后結(jié)扎，最后分層關(guān)閉腹腔。手術(shù)以后連續(xù)3 d均給予造模組大鼠腹腔注射20萬(wàn)U青霉素。常規(guī)喂養(yǎng)4周以后，檢測(cè)左心室舒張末壓(LVEDP)，如果LVEDP≥15 mmHg即建模成功。在成功建立CHF模型后，將其隨機(jī)分成模型組8只、實(shí)驗(yàn)組8只。給予實(shí)驗(yàn)組大鼠曲美他嗪10 mg/(kg·d)灌胃，給予模型組和對(duì)照組大鼠等量的生理鹽水灌胃。3組大鼠均灌胃4周。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)對(duì)大鼠注射麻醉藥物以后，將其仰臥于手術(shù)臺(tái)上。于其頸部正中間的地方切口，在右側(cè)頸總動(dòng)脈分離以后，結(jié)扎遠(yuǎn)心端的頸總動(dòng)脈，將近心端的頸總動(dòng)脈用動(dòng)脈夾夾住。然后在結(jié)扎處與動(dòng)脈夾之間的動(dòng)脈上剪一個(gè)小口，插入一根充滿肝素鹽水的導(dǎo)管。測(cè)量3組大鼠的LVEDP、左心室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.4 腎功能指標(biāo)血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)的檢測(cè)在檢測(cè)完血流動(dòng)力學(xué)之后，于頸動(dòng)脈處采血備用。利用全自動(dòng)生化分析儀來(lái)測(cè)定3組大鼠的BUN、Scr水平。

1.5 心肌組織HE染色取適當(dāng)體積的心肌組織，用4%甲醛溶液將其固定12 h，用石蠟包埋切片，脫蠟，室溫下用蘇木素染色，用水快速?zèng)_淋30-60 s，用1%鹽酸溶液浸潤(rùn)1 s，用水沖洗1 min，室溫下用伊紅染色5-10 min，用水沖洗1 min。然后用梯度乙醇脫水，最后用二甲苯透明10 min，適量中性樹(shù)膠封片。水腫比例=水腫細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.6 腎組織Masson染色取適當(dāng)腎組織，4%甲醛溶液將其固定12 h，用梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，脫蠟，室溫下用蘇木素染色，水洗，加入Masson染液10 min，水洗，先后用1%冰醋酸溶液、2.5%磷鉬酸溶液浸洗，最后使用苯胺藍(lán)染液染色，0.2%冰醋酸溶液浸洗，乙醇脫水后用二甲苯透明封片。膠原纖維面積/視野面積的比值采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計(jì)算。

1.7 MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白檢測(cè)將剝離出的腎組織剪碎以后，分離蛋白且進(jìn)行濃度檢測(cè)。對(duì)蛋白進(jìn)行變性、電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，4℃孵育過(guò)夜，緩沖液洗膜之后，用0.02%的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，洗膜之后用增強(qiáng)型化學(xué)法(ECL)顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax比較與對(duì)照組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的LVEDP明顯升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低(均P<0.05)；與模型組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的LVEDP明顯降低，+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 3組大鼠BUN、Scr水平比較與對(duì)照組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的BUN、Scr明顯升高(均P<0.05)；與模型組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的BUN、Scr明顯降低(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 3組大鼠LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對(duì)照組，#P<0.05

2.3 3組大鼠心肌組織HE染色與對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠水腫比例明顯增大，心肌纖維排列明顯紊亂，細(xì)胞橫徑顯著增大、水腫(P<0.05)；與模型組大鼠比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠水腫比例明顯減小，心肌纖維排列比較整齊，細(xì)胞腫脹程度明顯減輕(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表3。

表2 3組大鼠BUN、Scr水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對(duì)照組，#P<0.05

圖1 3組大鼠心肌組織HE染色(HE×400)

2.4 3組大鼠腎組織Masson染色與對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠腎組織膠原纖維面積/視野面積的比值增大，腎小球毛細(xì)血管處膠原纖維增生明顯增加(P<0.05)；與模型組大鼠比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織膠原纖維面積/視野面積的比值明顯減小，腎小球毛細(xì)血管處膠原纖維增生明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表3。

圖2 3組大鼠腎組織Masson染色(Masson×200)

表3 3組大鼠心肌HE染色水腫比例、腎組織Masson染色視野面積比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對(duì)照組，#P<0.05

2.5 3組大鼠腎組織MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較與對(duì)照組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(均P<0.05)；與模型組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)，見(jiàn)圖3，表4。

表4 3組大鼠腎組織MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對(duì)照組，#P<0.05

3 討論

目前，CHF在我國(guó)的發(fā)病率以及死亡率每年都在持續(xù)上升，其是由有多種病因共同作用導(dǎo)致的，而且CHF患者經(jīng)常會(huì)伴隨出現(xiàn)腎衰竭的癥狀[4]。由CHF引起的腎衰竭稱之為心腎綜合征，是CHF的終末階段。近些年來(lái)，隨著社會(huì)老齡化的加劇慢性心血管疾病的發(fā)病率也在逐年上升，且經(jīng)常有腎衰竭的現(xiàn)象出現(xiàn)。為了阻止心力衰竭與心腎綜合征的出現(xiàn)，阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活與心室重塑是非常有必要的[5]。曲美他嗪可以保護(hù)心肌細(xì)胞功能，經(jīng)常用于心臟的研究中。有研究報(bào)道，曲美他嗪可以改善大鼠心力衰竭模型神經(jīng)激素的分泌，保護(hù)心腎功能[6]。

圖3 3組大鼠腎組織MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量

本文研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠相比較，模型組大鼠的LVEDP明顯升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低(均P<0.05)，這說(shuō)明大鼠舒張功能與心臟收縮在術(shù)后都有明顯下降，表示CHF模型建立成功。與模型組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的LVEDP明顯降低，+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高(均P<0.05)，與對(duì)照組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的BUN、Scr明顯升高(均P<0.05)；與模型組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的BUN、Scr明顯降低(均P<0.05)，這說(shuō)明曲美他嗪具有保護(hù)心腎功能的作用。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，通過(guò)HE染色對(duì)3組大鼠心肌組織進(jìn)行病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與模型組大鼠比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠水腫比例明顯減小，心肌纖維排列比較整齊，細(xì)胞腫脹程度明顯減輕(P<0.05)。與張紅等人文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[7]。

CHF會(huì)引發(fā)患者出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化，其是所有慢性腎臟疾病的最終階段[8]。腎小管間質(zhì)纖維化的主要特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)會(huì)過(guò)度沉積在腎間質(zhì)中[9]。Ⅳ型膠原作為腎小球基底膜的重要組成成分，能夠被金屬蛋白酶(MMPs)家族的兩個(gè)關(guān)鍵成員MMP-2、MMP-9調(diào)節(jié)降解，MMP-2、MMP-9可以通過(guò)調(diào)節(jié)Ⅳ型膠原的降解來(lái)調(diào)節(jié)生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下腎臟ECM的代謝平衡[10]。α-SMA作為一種特異性蛋白，可以用來(lái)標(biāo)記腎小管間質(zhì)纖維化[11]。TGF-β能夠通過(guò)介導(dǎo)腎間質(zhì)發(fā)生纖維化與腎小球出現(xiàn)硬化來(lái)直接調(diào)控腎小球的損傷過(guò)程[12]。腎小管上皮細(xì)胞在受到刺激以后，會(huì)分化成肌成纖維細(xì)胞，通過(guò)增加結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和TGF-β的水平而出現(xiàn)腎纖維化[13]。本文研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)，可以進(jìn)一步說(shuō)明曲美他嗪能夠改善CHF大鼠腎臟纖維化的程度。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，通過(guò)Masson染色對(duì)3組大鼠腎組織進(jìn)行病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與模型組大鼠比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織膠原纖維面積/視野面積的比值明顯減小，腎小球毛細(xì)血管處膠原纖維增生明顯減少(P<0.05)。這一結(jié)果與譚淑娜等人的結(jié)果吻合[14]。

綜上所述，曲美他嗪可以明顯保護(hù)CHF大鼠的心腎功能，能夠改善心腎組織結(jié)構(gòu)。