大鼠正畸干預時牙移動對牙周組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達的影響及其意義

高再冕，李萬順

(1.平頂山市平煤總醫院 口腔科，河南 平頂山467000;2.鄭州大學第四附屬醫院 口腔科，河南 鄭州467000)

正畸治療中牙移動以牙周組織改建為生物學基礎[1]。研究發現[2]wnt/β-catenin信號通路對牙周膜細胞分化、功能及牙周膜、牙槽骨生理代謝調控具有非常重要的作用。wnt3a在骨陷窩中表達，屬于wnt蛋白一種重要的亞型[3]。通過與細胞膜受體結合激活該通路，是一種潛在的干細胞，對促進內源性干細胞增殖的生長因子具有誘導作用，從而促進細胞的自我更新及組織修復[4]。同時，可抑制糖原合成激酶-3β對β-catenin的磷酸化，促進細胞質中β-catenin的大量蓄積[5]。β-catenin是一種具有細胞黏附作用以及轉錄調節作用的多功能蛋白，在經典wnt/β-catenin信號通路中發揮著關鍵的作用[6,7]。本研究通過探索正畸牙齒過程中加力1、3、5、7、10、14天后張力區、壓力區Wnt3a、β-catenin蛋白、 mRNA表達的變化來證實wnt3a、β-catenin對成骨細胞分化、骨量調節的作用及在正畸牙齒移動過程中對牙周組織改建的影響。現將報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取7周齡健康雄性SD大鼠48只，體質量220-250 g，喂養于自由進食進水、光照12 h、室溫23℃-25℃、相對濕度45%-60%的環境中；所有實驗大鼠購買自南方醫科大學動物實驗研究中心。

1.2 動物分組及干預方法

建立大鼠正畸治療中牙移動的模型，選擇7周齡、220-250克左右健康SD大鼠48只(均由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供)，根據加力后第1、3、5、7、10、14天進行分組，每組8只。麻醉采用10%水合氯醛腹腔注射，將麻醉后大鼠固定。用結扎絲將大鼠左上頜第一磨牙與中切牙之間結扎并拴上施加50克力的鎳鈦螺旋拉簧。將第一磨牙拉向正中，以上頜切牙軸角近牙齦處拉出0.5 mm左右的深槽溝并用樹脂固定。對照組為右側未安裝正畸加力裝置組。

1.3 組織制備

全麻后采用心臟灌注的方式將大鼠處死，將上頜兩側第一磨牙及其牙周組織完整保留。用4%的多聚甲醛固定48 h后用15%ph=7.4的EDTA微波脫鈣6周，流水沖洗24 h，再用系列乙醇-正丁醇脫水，二甲苯透明，浸蠟。包埋面定位上頜三顆磨牙腭側面，以平行于上頜磨牙牙體長軸為標準，近、遠、中向連續切片，切片厚度為4 μm，并進行免疫組化檢測。

1.4 免疫組化檢測

兔抗大鼠多克隆抗體1∶100由北京博奧森生物試劑公司提供，sv0002-兔IgG兩步法免疫組化檢測試劑盒及DAB顯色盒均購自武漢博士德生物公司。操作步驟嚴格按照試劑盒及顯色盒的規定進行。選取各個時間點第一磨牙近中根近中、遠中牙周膜的高倍鏡視野進行攝像，所得攝像存于Image-ProPlus6.0系統進行圖像分析，計算各組標本陽性染色區域的平均光密度。

1.5 逆轉錄-PCR法

1.5.1總RNA的提取 取大鼠第一磨牙壓力側、左側上頜第一磨牙、右側上頜第一磨牙牙槽骨組織均100 mg放入研磨缽中加液氮進行研磨。取組織粉末至于1.5 ml的EP管中加1 ml Trizol劇烈震蕩15 s后室溫條件下靜置5-10 min加200 ml氯仿在12 000 rpm的條件下離心15 min，取400-500 μl上層水相加入0.5 ml乙丙醇充分混勻，在12 000 rpm條件下離心10 min棄異丙醇。加1 ml 75%乙醇混勻在8 000 rpm離心條件下進行離心5 min倒掉乙醇。濾紙上曬干5 min得到總RNA。

1.5.2逆轉錄合成cDNA 體系如下：5 μl的5×Reaction Buffer、3 μl 10 mM dNTP Mixture、1 μl oligodT、1 μl RNase Inhitor、1 μl Reverse Transcriptase 、3 μg Total RNA、14 μl DEPC H2O混勻后快速離心1次放入PCR儀中。逆轉錄反應條件如下：40℃1 h、70℃5 min置于-20℃條件下冰箱保存。PCR反應體系具體為：10 μl 2×Taq PCR Master Mix、0.15 μl rTaq酶、1 μl 上游引物、1 μl 下游引物、3 μl 反轉錄反應液、4.85 μl ddH2O PCR反應條件為35個循環，95℃30 s，58℃20 s，72℃25 s，GAPDH為內參物，最終得到wnt3a、β-catenin mRNA擴增產物。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a、β-catenin蛋白表達情況

不同時間組別壓力區、張力區大鼠牙周組織的Wnt3a、β-catenin蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)，均隨時間的推移呈現先升高后降低趨勢，壓力區和張力區β-catenin蛋白表達分別于加力后第5天和第7天達高峰，而Wnt3a蛋白表達均于加力后第5天達高峰，見圖1，圖2；不同時間組別對照區Wnt3a、β-catenin蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。A、B、C、D、E、F組張力區的Wnt3a、β-catenin蛋白表達均顯著高于對照區和壓力區(P<0.05)； C、D、E、F組壓力區的Wnt3a、β-catenin蛋白表達均顯著高于對照區(P<0.05)，見表1、表2。

圖1 不同組別大鼠牙周組織的β-catenin蛋白表達

圖2 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a蛋白表達

表1 不同組別大鼠牙周組織的β-catenin蛋白表達情況光密度值)

注：與同組對照區比較，*P<0.05；與同組壓力區比較，#P<0.05。與同區C組比較，△P<0.05；與同區D組比較，□P<0.05

2.2 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a、β-catenin mRNA表達情況

不同時間組別壓力區、張力區大鼠牙周組織的Wnt3a、β-catenin mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)，均隨時間的推移呈現先升高后降低趨勢，壓力區和張力區β-catenin mRNA表達均于加力后第7天達高峰，而Wnt3a mRNA表達均于加力后第5天達高峰，見圖3，圖4；不同時間組別對照區Wnt3a、β-catenin蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。A、B、C、D、E、F組張力區的Wnt3a、β-catenin mRNA表達均顯著的高于對照區和壓力區(P<0.05)； C、D、E、F組壓力區的Wnt3a、β-catenin mRNA表達均顯著的高于對照區(P<0.05)。Wnt3a、β-catenin mRNA表達電泳圖見圖5、圖6。

表2 不同組大鼠牙周組織的Wnt3a蛋白表達情況光密度值)

注：與同組對照區比較，*P<0.05；與同組壓力區比較，#P<0.05。與同區C組比較，△P<0.05

圖3 不同組別大鼠牙周組織的β-catenin mRNA表達

圖4 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a mRNA表達

圖5 各組不同區域β-cateninPCR電泳圖

圖6 各組不同區域Wnt3am PCR電泳圖

表3 不同組別大鼠牙周組織的β-catenin mRNA表達情況相對表達)

注：與同組對照區比較，*P<0.05；與同組壓力區比較，#P<0.05。與同區D組比較，△P<0.05

表4 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a mRNA表達情況相對表達)

注：與對照區比較*P<0.05，與壓力區比較#P<0.05；與同區C組比較，△P<0.05

3 討論

正畸作用下壓力區牙周膜受壓變窄常會引起破骨細胞活躍，并促進相關因子表達，從而增強骨吸收[8]。臨床研究發現[9]正畸過程中加注wnt3a信號通路抑制劑DKK1阻斷wnt信號通路。主要機制是通過直接或間接手段與wat蛋白競爭性結合低密度脂蛋白受體相關蛋白，從而使信號向細胞內傳遞的能力減弱，骨形成減少。說明干擾wnt蛋白通路可影響破骨細胞誘導骨吸收程度，進一步阻礙骨重建。wt3a是want信號通路重要的Wnt蛋白亞型，對成骨細胞增殖、分化、成熟起著重要的調控作用，同時還可以促進成骨細胞分泌相關因子發揮對破骨細胞分化的誘導作用，對促進成骨、抑制骨吸收均具有重要意義。外在機械力作用成骨細胞影可響骨改建[10]。有研究發現[11]牙周復合體中某些細胞能夠響應wnt刺激。通過激活或抑制wnt/β-catenin信號通路能導致牙周膜中成骨因子的表達水平的改變，從而對牙周膜寬度及牙槽骨更新造成影響。此外，wnt3a作為經典wnt蛋白的配體，通過對成骨細胞分化的直接誘導作用、對破骨細胞分化的礦化及抑制作用以及相關功能的表達來調控骨改建。研究結果顯示A、B、C、D、E、F組張力區的Wnt3a、β-catenin蛋白表達均顯著的高于對照區和壓力區(P<0.05)； C、D、E、F組壓力區的Wnt3a、β-catenin蛋白表達均顯著的高于對照區(P<0.05)與李爭爭等發現[12]wnt3a蛋白在骨折愈合過程損傷部位的表達上調結果一致。說明wnt/β-catenin信號通路通過上調wnt3a表達提高骨損傷修復能力。wnt3a在張力區表達上調程度顯著。其原因主要是由于wnt3a作為促進成骨細胞形成且向骨細胞分化及抑制骨細胞吸收的重要want蛋白亞型，在機械力刺激的條件下表達增強。張力區牙周膜受牽拉增寬，成骨相關轉錄因子表達增強。本研究結果顯示Wnt3a表達上調，可充分說明上調wnt3a mRNA水平使wnt3a分泌增加，促進骨重建。相關研究證實[13]基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)是骨細胞分化過程中重要的物質，可調控膠原分泌及骨基質成分組成，最終影響骨改建。經典wnt/β-catenin信號通路、骨形態蛋白-2是MMP-13重要的調控蛋白。其水平的增加能夠促進成骨細胞的分泌與本研究結果一致。

β-catenin信號通路受wnt蛋白家族的影響，wnt蛋白通過與受體結合后可抑制β-catenin被磷酸化，使其在細胞質中大量蓄積，并轉移至細胞核內與相應轉錄因子相互作用，從而激活下游靶基因轉錄。β-catenin是內源性骨量調節者，同時也是具有細胞間黏附和轉錄調控作用的多功能蛋白。本研究結果顯示β-catenin蛋白及其mRNA表達上調，充分說明其在正畸牙齒移動牙周組織改建過程中意義重大。其機制主要通過經典wnt/β-catenin信號轉導通路來實現。Wnt3a、β-catenin可調節成骨細胞中護骨素(OPG)的表達與楊先炯等報道[14]間充質細胞中want3a激活的經典wnt信號途徑使OPG表達上調結果一致。更有體外研究證明[15]缺乏 β-catenin可致成骨細胞成熟和礦化受阻，OPG含量下降，破骨細胞活躍，不利于骨重建。由此推斷Wnt信號通過影響OPG生成，決定牙周疾病進展及牙槽骨組織的改建。

綜上所述，大鼠行正畸治療中牙移動中，Wnt3a、β-catenin mRNA蛋白表達上調，參與牙周組織重建，并且主要于第5天、第7天達到高峰。本研究的創新之處在于，通過分析正畸牙齒移動過程中加力1、3、5、7、10、14天后張力區、壓力區Wnt3a、β-catenin蛋白、 mRNA表達的變化，進而證實Wnt3a、β-catenin對成骨細胞分化、骨量調節的重要作用。確定其在正畸牙齒過程中牙周組織改建中的影響，對正畸效果的評價提供科學的指標。