MYH10在結直腸癌中的表達及意義

李凱迪，王 海，鄭 巖，何成彥，齊 新

(吉林大學白求恩第三醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

2018年全球約有88萬人死于結直腸癌，在癌癥死亡率中排名第二[1]。因此，本實驗目的在于分析MYH10在結直腸癌組織中的表達量及臨床意義，為結直腸癌的診斷探索新的標志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究所納入的標本為吉林大學白求恩第三醫院2016年7月到2017年1月經手術獲得的經病理學檢測所證實為結直腸癌Dukes B期腺癌，在術前未接受任何治療，且排除已發生遠端轉移的患者的新鮮結直腸癌組織，共計23例。癌旁標本為距離癌組織10 cm以上且位于癌組織上段的正常組織。所有患者和家屬均簽署知情同意書。將依據以上標準所獲取的新鮮組織沖洗后，經液氮速凍后，置于-80℃的冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1樣本總蛋白提取及測定 從-80℃的冰箱中，取癌組織和癌旁組織各50 mg于PBS中清洗，在液氮中充分研磨后，分別加入適量RIPA裂解緩沖液，置于冰上，室溫下，使用振蕩器充分混勻。加入RNA酶和DNA酶去除RNA和DNA后離心。離心機設置為12 000 rpm，4℃，離心15 min。離心后，留取上層清液即為總蛋白。蛋白質濃度測定根據Bradford法，即使用考馬斯亮藍染液進行染色，使用分光光度計在595 nm處進行測量。繪制橫坐標為蛋白質濃度，縱坐標為吸光度的蛋白質濃度標準曲線。

1.2.2蛋白水解多肽混合物的制備 取凍存的總蛋白樣品，置于室溫下融化。用5倍體積的50 mmol/L NH4HCO3溶解稀釋蛋白樣品。加入一定體積的1 mol/L的DTT，最終調定濃度為20 mmol/L，56℃下避光放置反應1 h。冷卻至室溫后加入一定體積的1 mol/L的IAM，調定濃度至50 mmol/L，室溫避光的條件下，使其充分反應30 min。在反應體系中按蛋白∶胰酶以50∶1的比例加入測序級胰酶，置于37℃水浴箱中過夜，所得產物分裝后置于-80℃的冰箱中保存。

1.2.3二維色譜質譜聯用技術分析 取經上述步驟制得的樣品加入0.1%FA溶解樣品。取50 μg用于色譜上樣，蛋白樣品在流經強陽離子柱和反相柱時被洗脫分離，所獲得的多肽經LTQXL離子肼質譜分析后，最終得到LC/MS圖譜。

1.2.4免疫印跡試驗 用免疫印跡試驗分別測定目的蛋白(MYH10)在結直腸癌組織和癌旁組織的表達情況，以驗證二維色譜與質譜聯用技術的分析結果。

1.2.5儀器和試劑 考馬斯亮藍、二硫代蘇糖醇(DTT)、NH4HCO3、碘代乙酰胺(IAM)、尿素、DNA酶、RNA酶購于美國Sigma公司，十二烷基硫酸鈉(SDS)、TMED、蛋白質定量試劑盒、TPCK修飾的測序級胰酶購于Bio-Rad公司，苯甲基磺酰氟(PMSF)購于美國GE公司，MYH10單克隆抗體購于美國Abcam公司。Agilent 1200高效液相色譜儀購于美國Agilent公司，LTQXL離子肼質譜儀購于美國Thermo Fisher公司。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 二維色譜與質譜聯用技術分析結直腸癌組織和癌旁組織

本實驗癌組織樣本和癌旁組織樣本中同一個蛋白的豐度通過譜圖數以衡量。我們將同時滿足兩個樣品中蛋白譜圖數比值≥1及兩個樣本中蛋白譜圖數差值≥72的蛋白定為差異表達蛋白，依照上述標準，發現本次實驗所研究的MYH10蛋白為上調蛋白，MYH10質譜圖結果見圖1。

圖1 MYH10質譜圖

2.2 免疫印跡試驗分析MYH10在結直腸癌和癌旁組織的表達

使用免疫印跡試驗分析MYH10在結直腸癌組織和與之相對的癌旁組織的表達情況，結果顯示，MYH10蛋白在結直腸癌組織中的表達量明顯高于癌旁組織，與二維色譜與質譜聯用技術所獲得的結果一致，免疫印跡試驗結果見圖2。

圖2 MYH10在癌旁組織(A)、結直腸癌組織(B)

3 討論

非肌肉肌球蛋白(NMM-Ⅱ)是一種六聚體分子，由2條重鏈、2條調節性輕鏈和2條必須輕鏈所構成的。其3種亞型分別為NMMⅡ-A、NMMⅡ-B和NMMⅡ-C分別由MYH9、MYH10和MYH14基因編碼[2]。有報道表明NMM-Ⅱ作為細胞骨架的關鍵調節因子之一，參與了如細胞活化、囊泡轉移等一系列的細胞活動[3]。

MYH10作為超家族蛋白質編碼基因之一，位于17p13.1,廣泛的存在于不同的細胞和組織中[4]。除了參與正常的細胞生理活動，同時與癌癥的發生、發展密切相關[5]。Liu等人通過對膀胱癌的研究證實，MYH10可以作為影響膀胱癌患者預后的候選生物標志物之一[6]。Bluteau等人的研究表明，MYH10受RUNX1基因負向調控，當RUNX1基因缺失，MYH10在血小板中持續性表達，遺傳性和獲得性血液系統惡性腫瘤的發生可能與之相關?？梢詫z測MYH10基因作為血液系統惡性腫瘤的篩選標記物[7]。劉等人的研究表明，MYH10基因的表達與卵巢癌細胞的增殖、遷移、侵襲的能力高度相關。該研究還證實MYH10基因的表達量與卵巢癌的復發、轉移以及腸道轉移呈正相關，可以作為卵巢癌患者的獨立預后因素[8]。Guo等人的研究認為MYH10基因可以改變ECM(細胞外基質)[9]。大量的研究表明，腫瘤細胞外基質成分的變化對腫瘤的發展起著重要的調控作用[10]。Wang等人沉默人腦膠質瘤細胞中的MYH10基因后發現Wnt/β-catenin信號通路受到抑制[11]，先前的研究表明，Wnt/β-catenin通過促進上皮-間質轉化(EMT),即上皮細胞向間質細胞轉化，大大提升了腫瘤的抗凋亡能力，使細胞的轉移和侵襲能力增強。而抑制Wnt/β-catenin信號通路可以減弱腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[12]。Surcel等人的研究表明4-羥基苯乙酮(4-HAP)通過靶向調控MYH10以及MYH14改變細胞力學，減弱了胰腺癌細胞的侵襲性和轉移，為癌癥治療提供了新思路[13,14]。先前的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在結直腸癌的發生、發展起到了關鍵的作用[15]。MYH10基因是否通過激活Wnt/β-catenin信號通路，增強腸癌細胞的侵襲和轉移，最終影響結直腸癌患者的預后，還需要進一步的實驗以驗證。

本實驗通過二維色譜-質譜聯用技術分析了結直腸癌腫瘤組織和癌旁組織的MYH10蛋白表達情況，并通過免疫印跡的方法得以驗證，結果顯示MYH10蛋白在結直腸腫瘤組織中明顯升高，可以作為診斷結直腸腫瘤的候選生物標志物之一。