NALP3炎性體、骨形態發生蛋白在退變腰椎間盤髓核組織中的表達及意義

鄧劍鋒,李廣章,劉 然,齊穎釗,劉志新

(秦皇島市第一醫院 骨三科,河北 秦皇島066000)

腰椎間盤突出癥是脊柱外科最常見的病癥之一，腰椎間盤退變是引起腰椎間盤突出癥的病理基礎，主要表現為纖維環原與髓核之間清晰界限消失，凝膠樣髓核消失[1,2]。有學者研究表示，腰椎間盤退變由營養、遺傳、免疫、力學等多種因素共同造成，力學因素最為直接，直接作用于人們的直立行走[3]。腰椎間盤在行走過程中容易受到損傷，導致機體炎性因子和免疫反應被激活，使細胞核收到退變信號，影響椎間盤關鍵組分的合成和講解以及核內基因表達。有學者研究中表示，椎間盤退變的發展和發生中細胞細胞外基質合成，細胞外基質分解代謝失衡起著重要作用[4]。本文研究核苷酸結合寡聚化結構域樣受體含熱蛋白結構域3(NALP3炎性體)、骨形態發生蛋白BMP-2在退變腰椎間盤髓核組織中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對象：在我院選取2017年6-2018年6月接受治療的80例腰椎間盤突出癥患者，男性41例，女性39例，年齡21-54歲，平均年齡(36.5±13.6)歲；病程1-6，平均病程(4.3±1.5)年。腰椎間盤突出癥患者椎間盤退變使用Pfirrmann分級標準進行MRI分級，Ⅱ級患者16例，具有輕度退變，輕微降低加權信號強度；Ⅲ級29例，中度退變，中度降低加權信號強度；Ⅳ級21例，嚴重退變，明顯降低加權信號強度；Ⅴ級14例，嚴重退變，嚴重降低加權信號強度。另外選取在我院行前路減壓內固定切除的脊柱骨折患者椎間盤為正常椎間盤髓組織，男性45例，女性35例，年齡22-51歲，平均年齡(35.6±11.2)歲，兩組患者一般資料比較無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。

納入標準：腰椎間盤突出癥患者具有臨床典型癥狀、體征，經過X線檢查患者椎間隙明顯下降，MRI顯示腰椎間盤突出，TW2髓核信號降低。所有患者及其家屬對本文研究均知情，并簽署知情同意書。

排除標準：排除類風濕關節炎疾病者及感染性疾病者；排除合并腫瘤者；排除凝血功能異常者，排除精神疾病者，排除嚴重心腎肺功能不完全者。

1.2 方法

1.2.1標本制作 將所有腰椎間盤突出癥患者進行手術切除，取出在纖維環內的椎間盤髓核組織。另外選取在我院行前路減壓內固定切除的青壯男脊柱骨折患者椎間盤為正常椎間盤髓組織。隨機取出0.5 cm2大小的退變椎間盤髓核組織塊，并行常規石蠟包埋，厚度為3 cm，在0-4℃的冰箱內保存。連續切片作免疫組化標記。

1.2.2免疫組化染色 將待測標本進行脫蠟、水化后，浸泡在0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中，并進行熱修復，培育在3%的H2O2的環境下，在山羊血清中滴入10 min后進行封閉，在25-27℃的環境下孵育0.5 h，然后抽離封閉液，將一抗加入，培養在5℃的環境中過夜，第2天加入而抗，并培養在37℃的恒溫箱中0.5 h，使用PBS淋液沖洗后進行DAB顯示、脫水、封片處理。

1.2.3NALP3炎性體檢測 使用Western Blot檢測，將PBS緩沖液清洗標本3次進行分離緩沖液裂解0.5 h，對蛋白濃度進行測定。取20 μg/孔蛋白質，在電泳10 min后加入適量SDS-PAGE蛋白緩沖液，將電轉膜在10%的牛奶中浸泡，封閉在常溫1.5 h的搖床上；使用TBST與一抗結合之后進行稀釋，并孵育、保存；第2天使用TBST液進行清洗，與二抗結合后常溫孵育1 h，再清洗，加入顯影劑顯色，對NALP3炎性體水平進行測定。

1.2.4BMP-2標本檢測 檢測BMP-2水平使用酶聯免疫吸附試驗法，緩沖液稀釋50 mM碳酸鹽包BMP-2抗原，之后添加到聚苯乙烯的反應板孔中，放置24 h溫度4 ℃，次日洗滌劑洗滌3次后，拋干。在各孔中加入稀釋液稀釋的待測標本0.1 ml，同時加入陽性和陰性的對照標本，42 ℃放置60 min，將液體移除洗滌3次后，拋干。在各孔中加入BMP-2的酶標抗體0.1 ml，43 ℃放置60 min。液體移去，洗滌3次，拋干。在各個空中加入0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸滴液混勻,再加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光處理20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 ml，終止反應。使用酶標儀檢測405，分析BMP-2水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 兩組研究對象NALP3、BMP-2表達比較

如表1、圖1、圖2所示，腰椎間盤組患者NALP3、BMP-2表達與正常組NALP3、BMP相對表達水平相比，腰椎間盤組患者NALP3表達升高，BMP-2表達降低，差異具有統計學差異(P<0.05)。

表1 兩組研究對象NALP3、BMP表達比較

圖1 NALP3、BMP-2在退變椎間盤髓核組織中的表達免疫組化染色圖(×200)

圖2 NALP3、BMP-2在正常椎間盤髓核組織中的表達免疫組化染色圖(×200)

2.2 NALP3、BMP-2與退變等級的關系

如表2所示，與Ⅱ級相比，Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統計學差異(P<0.05)；與Ⅲ級相比，Ⅳ級、Ⅴ級患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統計學差異(P<0.05)；與Ⅳ級相比，Ⅴ級患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統計學差異(P<0.05)。

表2 NALP3、BMP-2與退變等級中的關系

注：與Ⅱ級比較，aP<0.05；與Ⅲ級比較，bP<0.05；與Ⅳ級比較，cP<0.05。

2.3 NALP3、BMP-2與患者腰部負荷嚴重程度的關系

如表3所示，與很輕程度相比，輕、中、重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統計學差異(P<0.05)；與輕程度相比，中、重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統計學差異(P<0.05)；與中程度相比，重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統計學差異(P<0.05)。

表3 NALP3、BMP-2與患者腰部負荷嚴重程度

注：與很輕程度比較，aP<0.05；與中程度比較，bP<0.05；與重程度比較，cP<0.05。

2.4 NALP3、BMP-2之間相關性分析

NALP3、BMP-2之間進行Pearson相關性分析，NALP3、BMP-2之間呈負相關(r=-0.269，P=0.016)。

3 討論

腰椎間盤細胞受外界因素影響，會導致細胞內分子水平變化，從而使細胞生物學行為變化[5]。研究證明，細胞外基質成分合成減少、分解增加也是造成腰椎間盤退變的主要因素，腰椎間盤退變是引起腰椎間盤突出的主要病理基礎，嚴重將導致腰腿痛[6]。腰椎間盤髓核細胞衰老是造成腰椎間盤退變的重要原因，是由炎性因子刺激、細胞能力代謝障礙等導致。細胞能量代謝障礙是腰椎間盤突出癥患者椎間盤退變的重要機制，一方面營養物質彌散障礙是軟骨終板老化所致，一方面線粒體變形、線粒體內滲透壓改變、炎性因子對線粒體的干擾是由力學因素所致且對細胞的能量代謝造成影響[7]。

NALP3炎性體是一種胞內模式識別受體，在激發免疫反應及炎性反應和調節免疫反應及炎性反應中具有調控作用[8]。研究顯示，一系列不同的內源性和外源性因素對NALP3炎性體刺激后，可以將依賴在半胱氨酸激酶的活性激活[9]。炎性半胱天冬酶-1在鉀內流、活性氧及溶酶體等因素的作用下被激活，從而使NALP3炎性體發生募集組裝，以促進血管內皮細胞與白細胞黏附、滲透，使機體局部炎癥發生[10]。研究中顯示，NALP3炎性體在治療的靶點具有一定應用價值，腰椎間盤突出癥患者退變腰椎間盤髓核衰老以后NALP3炎性體表達越高，腰椎間盤突出癥患者疼痛感癥狀越重[11,12]。

骨形態發生蛋白作為多功能生長因子，是轉化生長-β超家族的一員，屬于在骨和骨髓中提取的特殊蛋白質，具有一定的誘導作用[13,14]。在腰椎間盤退變的發生和發展中細胞外基質合成和分解代謝失衡具有重要作用[15,16]。骨形態發生蛋白還是一種多效的形態發生素，可以促進細胞外基質的合成[17]。研究顯示，腰椎間盤細胞外基質合成代謝的重要因子之一BMP-2，可以促進體外培養腰椎間盤細胞的Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成以及表達[18,19]。同時，BMP-2在腰椎間盤退變中有一定的調節作用，參與腰椎間盤退變整個過程的調節[20]。

本文研究結果顯示，在兩組研究對象中，退變腰椎間盤髓核組織中NALP3炎性體表達量明顯升高，BMP-2表達明顯下降；腰椎間盤突出患者Ⅱ級退變腰椎間盤髓核組織中NALP3炎性體表達量低于Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級患者，BMP-2表達量高于Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級患者；腰椎間盤突出患者腰部負荷重程度退變腰椎間盤髓核組織中NALP3炎性體表達量高于很輕、中程度患者，BMP-2表達量低于很輕、中程度患者。說明腰椎間盤突出患者退變腰椎間盤髓核組織中NALP3炎性體、BMP-2存在重要的參與作用。

綜上所述，NALP3炎性體在腰椎間盤突出患者退變腰椎間盤髓核組織中高表達，BMP-2在腰椎間盤突出患者退變腰椎間盤髓核組織中低表達，其表達水平與患者退變腰椎間盤髓核組織中退變等級、腰部負荷程度相關，NALP3炎性體、BMP-2在退變腰椎間盤髓核組織中起到重要的參與作用。