慢性HBV感染患者細(xì)胞免疫與miRNA-155表達(dá)相關(guān)性探究

梁 騎，楊尚瑜，鄧健康，王東生，郭曉蘭*

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 南充637100；2.川北醫(yī)學(xué)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川 南充637100)

微小核糖核酸(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的非編碼單鏈RNA，其長(zhǎng)度在21-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)，其以序列特異性方式轉(zhuǎn)錄后，對(duì)人體的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[1]。miRNA對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的途徑主要是通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，其結(jié)合方式有完全和不完全互補(bǔ)兩種形式[2]。miRNA-155是由B細(xì)胞非編碼基因整合集群中(21號(hào)染色體內(nèi))第3個(gè)外顯子編碼而成，數(shù)項(xiàng)研究表明該miRNA參與了人體多項(xiàng)生物學(xué)功能如炎癥、心血管疾病以及腫瘤的發(fā)生和免疫功能等[3-5]。近年來，有研究報(bào)道稱HBV病毒感染同樣有miRNA-155參與在內(nèi)[6]，但其中兩者的具體相關(guān)性鮮有報(bào)道，本研究針對(duì)miRNA-155與慢性HBV感染患者展開相關(guān)性研究，初步探求兩者具體相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月到2019年2月我院收治的慢性HBV患者40例設(shè)為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南2015年版》[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)入院前6個(gè)月內(nèi)未接受免疫調(diào)節(jié)劑治療；(3)預(yù)計(jì)生存時(shí)間>1年。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)先天性或獲得性免疫缺陷；(2)肝癌患者；(3)存在重要臟器功能障礙者。選取同期入院檢查的健康個(gè)體40例設(shè)為對(duì)照組，所有人員簽署知情同意書，并經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

采集所有人員禁食12 h后空腹靜脈血4 ml兩份，其中一份3 370×g離心10 min，取上清液并轉(zhuǎn)移至兩份1.5 ml無菌去酶離心管中，于-80℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫崛iRNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，采用熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-155水平，以cel-mir-39-3p為外參基因?qū)ζ溥M(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的校準(zhǔn)，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；另外一份血液樣本于流式試管中立即加入抗凝血CD4異硫氰酸熒光、CD8藻紅蛋白各100uL，以及CD3多甲藻黃素—葉綠素—蛋白質(zhì)復(fù)合物等20 μl(均購(gòu)自美國(guó)BD公司)，依次經(jīng)過避光反應(yīng)、紅細(xì)胞裂解、離心、棄上清后，加入磷酸鹽緩沖液1 ml，1000×g離心5 min并棄上清后，再次補(bǔ)入磷酸鹽緩沖液500 μl，混合均勻后使用流式細(xì)胞儀(型號(hào)BD FACS Calibur)進(jìn)行檢測(cè)，以 SSC/CD3作為設(shè)門，分別記錄抑制/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD4、CD8+)，以及輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8-)等的百分比，最后計(jì)算輔助/抑制T淋巴細(xì)胞(CD4+/CD8+)比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)資料都采用SPSS25.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，而所有的計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。對(duì)所有觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)行單因素分析，并進(jìn)一步進(jìn)行多因素回歸分析。所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果P<0.05評(píng)價(jià)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組人員基線資料的比較

兩組人員除性別、年齡比較無明顯差異外(P>0.05)，觀察組CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+明顯低于對(duì)照組，且miRNA-155相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD8+百分率兩組相比無明顯差異，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組人員基線資料的比較

2.2 多因素線性回歸分析

以miRNA-155相對(duì)表達(dá)量作為因變量，以T細(xì)胞亞群各指標(biāo)含量作自變量，進(jìn)行多因素線性回歸分析，結(jié)果顯示：CD3+百分率與miRNA-155呈正相關(guān)(B=0.050，P=0.000，95%CI=0.037-0.064)，其余指標(biāo)與miRNA-155并未表現(xiàn)出相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表2 多因素線性回歸分析結(jié)果

2.3 多因素Logistics回歸分析

以觀察組與對(duì)照組miRNA-155相對(duì)表達(dá)量作為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，建立狀態(tài)變量(觀察組患者miRNA-155=0，對(duì)照組miRNA-155=1)，同樣將所有人員T細(xì)胞亞群各指標(biāo)含量作自變量，進(jìn)行多因素Logistics回歸分析，結(jié)果顯示：CD3+百分率與miRNA-155表現(xiàn)出相關(guān)性(B=0.601，P=0.008，95%CI=1.171-2.838)，其余指標(biāo)與miRNA-155并未表現(xiàn)出相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表3 多因素Logistics回歸分析結(jié)果

3 討論

人體細(xì)胞免疫與多種疾病發(fā)病相關(guān)。謝服役等在其研究中表示[8]，慢性HBV患者病理損傷機(jī)制多樣，而患者所出現(xiàn)的細(xì)胞免疫功能紊亂是一種主要病理損傷機(jī)制。正常健康人體的T淋巴細(xì)胞構(gòu)成主要包括CD3+、CD4+以及CD8+T細(xì)胞3種細(xì)胞組成，在無任何免疫性疾病、嚴(yán)重并發(fā)癥等發(fā)病情況下，人體外周血T淋巴細(xì)胞亞群一直處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[9]；HBV病毒感染至乙肝病發(fā)的整個(gè)過程中，人體外周血T細(xì)胞亞群各類細(xì)胞數(shù)量會(huì)發(fā)生變化，同時(shí)其占比也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，T淋巴細(xì)胞原本的分布結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，患者機(jī)體逐漸出現(xiàn)免疫應(yīng)答反應(yīng)，致使患者肝細(xì)胞受到損傷，最終患者乙肝病情發(fā)展及疾病轉(zhuǎn)歸都會(huì)受到較大影響[10]。miRNA-155在人體內(nèi)多種免疫細(xì)胞中均有所表達(dá)，其中包括有：樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等，該miRNA主要起到對(duì)人體正常的免疫機(jī)制進(jìn)行調(diào)控的作用，Sarkar N等在其研究中[11]就肝病患者的miRNA-155表達(dá)量進(jìn)行了對(duì)照分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者的外周血單核細(xì)胞內(nèi)miRNA-155表達(dá)量相較于健康人群出現(xiàn)了明顯的下降；本研究結(jié)果顯示：兩組人員除性別、年齡比較無明顯差異外(P>0.05)，觀察組CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+明顯低于對(duì)照組，且miRNA-155相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果與其報(bào)道的類似，根據(jù)以上單因素分析比較我們可以發(fā)現(xiàn)，患者T細(xì)胞亞群各細(xì)胞含量均與miRNA-155表達(dá)量出現(xiàn)同步下降的趨勢(shì)，提示miRNA-155表達(dá)與慢性HBV感染患者細(xì)胞免疫可能存在一定相關(guān)性。

根據(jù)本研究結(jié)果的相關(guān)性研究結(jié)果顯示：以miRNA-155相對(duì)表達(dá)量作為因變量，以T細(xì)胞亞群各指標(biāo)含量作自變量，進(jìn)行多因素線性回歸分析，結(jié)果顯示CD3+百分率與miRNA-155呈負(fù)相關(guān)(B=-0.050，P=0.000，95%CI=-0.064～-0.037)；以觀察組與對(duì)照組miRNA-155相對(duì)表達(dá)量作為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，建立狀態(tài)變量(觀察組患者miRNA-155=0，對(duì)照組miRNA-155=1)，同樣將所有人員T細(xì)胞亞群各指標(biāo)含量作自變量，進(jìn)行多因素Logistics回歸分析，結(jié)果顯示CD3+百分率與miRNA-155表現(xiàn)出相關(guān)性(B=0.601，P=0.008，95%CI=1.171-2.838)，該結(jié)果表明CD3+百分率與患者miRNA-155表達(dá)量表現(xiàn)為正相關(guān)，這可以說明miRNA-155確與慢性HBV患者細(xì)胞免疫存在相關(guān)性。miRNA-l55表達(dá)量對(duì)于T細(xì)胞亞群含量起著至關(guān)重要的作用：當(dāng)患者miRNA-155表達(dá)量上升時(shí)，其可對(duì)患者機(jī)體內(nèi)B細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生一定增強(qiáng)作用，同時(shí)可以刺激患者機(jī)體產(chǎn)生高親合力抗體，并可能逐步引導(dǎo)患者T細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞分化[12]；但當(dāng)患者miRNA-155出現(xiàn)下降時(shí)，其機(jī)體免疫功能容易表現(xiàn)為抑制狀態(tài)，T細(xì)胞亞群各細(xì)胞含量則會(huì)出現(xiàn)下降，王穎智[13]等在其研究中對(duì)慢性乙肝患者血清中miRNA-155表達(dá)量下降的原因進(jìn)行了推測(cè)，結(jié)果表明，慢性乙肝患者血清中miRNA-155表達(dá)量相較于健康人群體內(nèi)miRNA-155表達(dá)量明顯更低，該現(xiàn)象可能由于慢性乙肝患者Toll樣受體7通過NF-JB通路進(jìn)行作用，以此抑制了miRNA-155在其體內(nèi)的正常表達(dá)，進(jìn)而使得患者出現(xiàn)免疫功能抑制，細(xì)胞免疫能力下降的現(xiàn)象，該情況可通過使用抗病毒藥物進(jìn)行緩解。

綜上所述，慢性HBV感染患者的miRNA-155表達(dá)量相較于正常人群明顯更低，這與其細(xì)胞免疫能力的抑制表現(xiàn)出了相關(guān)性，但該研究結(jié)果僅僅發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群中CD3+百分率與miRNA-155表達(dá)量呈正相關(guān)，但本研究例數(shù)有限，無法確定其準(zhǔn)確性，僅供參考。