Hsa_circ_0008934在原發性肝細胞癌診斷和預后評估中的臨床價值

宋麗娜，顧芳芳，楊 誠，喬光磊，馬俐君

(1.上海交通大學醫學院附屬同仁醫院 腫瘤科，上海200336;2.海軍軍醫大學第三附屬醫院 特需一科，上海200438)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發性肝癌中最主要的病理分型，約占75%-85%，其惡性程度高，病程進展快，預后差，是惡性腫瘤相關死亡的主要原因之一[1,2]。目前，早期手術切除仍是HCC主要的治療手段，但HCC起病隱匿，多數患者確診時已是中晚期，失去了根治性切除病灶的機會，致其五年生存率不足18.1%[3]。因此探索更有價值的生物學標志物對于提高HCC早期診斷水平及改善預后置關重要。

環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類不具有5′端帽子和3′端poly A尾的閉合環狀結構的RNA分子[4]，其廣泛存在于各種生物中，擁有結構保守穩定、組織特異性表達等特征[5]。近期研究表明，circRNA的主要功能包括調控宿主基因表達[6]、miRNA“海綿”作用[7]、提高轉錄水平[8]及翻譯蛋白質[9]等，并且與惡性腫瘤的發生發展、侵襲轉移密切相關[10-13]。circRNA具有特殊的環狀結構，不易被核酸外切酶降解，穩定性顯著優于線性RNA，并廣泛存在于腫瘤組織、血液及其他體液中[14,15]，因此其有望成為一種全新的生物學標記物應用于惡性腫瘤的早期診斷及預后評估。前期研究發現，hsa_circ_0008934在有門靜脈侵犯的HCC癌組織中高表達，本研究旨在探討其表達與HCC臨床病理特征及預后的相關性，分析其在診斷和預后評估中的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與研究對象

1.1.1主要試劑

Trizol LS試劑(Invitrogen),總RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit，QIAGEN)，PrimeScript RT Master Mix試劑盒(Takara，大連)，SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(Takara，大連)。

1.1.2研究對象

收集2013年8月至2016年7月海軍軍醫大學第三附屬醫院經手術切除的100例HCC患者的癌組織及配對癌旁組織，20例HCC患者入院手術前的空腹靜脈血，所有患者手術前沒有接受化療、放療、靶向治療及介入治療；收集同時期20例健康人的空腹靜脈血。本研究經上海市同仁醫院和海軍軍醫大學第三附屬醫院醫學倫理委員會批準，隨訪時間截止至2019年8月。

1.2 實驗方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成

取液氮凍存的HCC組織100 mg/例，在液氮中研磨組織成粉末狀，加入Trizol LS試劑1 ml提取總RNA；靜脈血分離出血漿后，按照試劑盒說明書提取總RNA；用NanoDrop ND-1000(Thero Fisher Scientific,Waltham,MA)檢測其濃度及純度，然后按照PrimeScript RT Master Mix試劑盒說明書制備cDNA，樣本置于-20℃保存。

1.2.2轉錄組測序(RNA-sequening,RNA-seq)

RNA-seq委托上海烈冰信息科技有限公司進行，提取3例有門靜脈侵犯的HCC和3例無門靜脈侵犯的HCC癌組織中的總RNA，通過RiboMinus試劑盒去除rRNA，Rnase R去除線性RNA；使用NEBNext RNA超快速定向文庫制備試劑盒(Illumina，美國)預處理RNA，構建測序文庫，Hiseq 2000(Illumina，美國)測序儀進行分析，差異基因的篩選標準：|log2FC|>1，且P值小于0.05。

1.2.3qPCR檢測

hsa_circ_0008934上游引物序列：5′-CCATCTCACATGCCACATACA-3′，下游引物序列：5′-ATATTCACACATTTGGAGCTGAA-3′，內參GAPDH上游引物序列：5′-GGGAGCCAAAAGGG-TCAT-3，下游引物序列：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′，由生工生物工程(上海)合成引物序列；使用LightCycler 480II (Roche)進行qPCR檢測，反應體系為20 μl，包括2x SYBR Premix Ex Taq 10 μl，上下游引物各0.5 μl，ROX 0.5 μl，cDNA樣本 0.5 μl，RNase-free H2O 8.1 μl；循環參數：預變性95℃ 5 min，95℃ 5 s，59℃ 10 s，72℃ 30 s，共40循環。采用2-△△Ct法計算相對表達量，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的純度及分子量。

1.2.4Sanger測序

測序PCR體系：總體積20 μl ，PCR產物30 ng，1 μl測序引物，2 μl測序染料，3 μl測序反應液，滅菌超純水補齊；擴增程序：96℃ 1 min；96℃ 10 s→50℃ 5 s→60℃ 4 min(25個循環)，4℃ 保溫。產物經純化后加入Hi-Di formamida充分振蕩溶解，95℃ 5 min→冰中冷卻4 min，然后通過ABI 3730測序儀分析。

1.2.5統計學方法

采用SPSS13.0軟件進行數據統計分析，計量資料采用均數±標準差描述，兩組間比較選擇獨立樣本t檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，應用單因素(log-rank)及多因素COX回歸模型分析，得到HCC預后的危險因素；Gradpad Prism5.0軟件繪制受試者工作特征曲線(Receiver operator characteristic curve,ROC)，分析hsa_circ_0008934的診斷價值，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hsa_circ_0008934在HCC中的表達

通過RNA-seq發現，兩組相比，在有門靜脈侵犯的癌組織中表達上調的circRNA有14個，其中顯著上調，并且國內外未見報道的circRNA為hsa_circ_0008934(圖1A)；qPCR檢測結果顯示，癌組織中hsa_circ_0008934的表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(7.83±1.67 vs 1.58±0.32，P<0.01，圖1B)；血漿中hsa_circ_0008934的表達水平顯著高于健康人(13.72±8.05 vs 0.94±0.69，P<0.01，圖1C)。瓊脂糖凝膠電泳表明PCR產物純度高、分子量大小(150 bp)正確(圖2A)，Sanger測序驗證PCR產物的backsplice位點正確(圖2B)。

圖1 hsa_circ_0008934在肝癌中的表達

A.RNA-seq發現差異表達circRNA(High：有門靜脈侵犯，Low：無門靜脈侵犯) B.癌與癌旁組織中hsa_circ_0008934的表達 C.血漿中hsa_circ_0008934的表達

圖2 PCR產物驗證

2.2 hsa_circ_0008934與HCC臨床病理特征相關性

hsa_circ_0008934高表達與腫瘤直徑(P=0.01)、AFP(P=0.03)及組織分化程度(P=0.01)顯著相關，而與年齡、性別、TNM分期、HBsAg、AST及ALT均無顯著相關(表1)。

2.3 hsa_circ_0008934的診斷價值

為了明確hsa_circ_0008934表達在HCC診斷中的價值，我們針對其血漿表達水平進行了ROC曲線分析，結果表明，hsa_circ_0008934表達在HCC中具有較好的敏感度(80%)和特異度(85%)，AUC為0.851，95%CI為0.703-0.944(圖3)。

2.4 hsa_circ_0008934的預后價值

根據癌組織中hsa_circ_0008934的相對表達中位值(2-△△Ct=7.52)分為高和低表達組，生存分析顯示低表達組患者的總生存時間(overall survival,OS)顯著長于高表達組(38.09±2.99 vs 26.58±2.15，P=0.032,圖4)。

2.5 預后單因素分析

單因素分析發現，影響HCC預后的危險因素為TNM分期(P=0.036)、AFP(P=0.029)和hsa_circ_0008934表達(P=0.037)(表2)。

2.6 預后多因素分析

將單因素分析有統計學差異的因素納入多因素分析，發現hsa_circ_0008934(P=0.033)和TNM分期(P=0.018)為影響HCC預后的獨立危險因素(表2)。

3 討論

原發性肝癌是一種全球高發的惡性腫瘤，每年新發病例約84萬，死亡約78萬，分別居惡性腫瘤的第6位和第4位[1]。HCC為原發性肝癌的主要病理類型，具有侵襲轉移能力強和預后差等特點。由于早期診斷率較低、晚期缺乏有效的治療手段導致該病預后差[16]，因此研究HCC發生發展的分子機制，尋找可靠穩定的診斷和預后評估分子標志物，對改善其預后至關重要。

表1 hsa_circ_0008934與HCC臨床病理特征的關系

圖3 hsa_circ_0008934的診斷價值

圖4 hsa_circ_0008934的預后價值

表2 HCC預后的單因素與多因素分析

CircRNA通過非線性反向剪接方式，將3′末端與5′末端連接在一起形成環狀結構，具有穩定性強、高度保守及組織特異性等特點[17]。近期研究發現，circRNA在HCC的發生發展中發揮重要作用[18,19]，某些還可穩定表達于唾液、血液及其他體液中，為其作為生物學標志物奠定基礎。hsa_circ_0000567在HCC癌組織中低表達，低表達水平與較大腫瘤直徑、較低分化及較差預后密切相關，可作為miR-421的分子海綿，通過靶向MAPK14，抑制腫瘤細胞生長，發揮抑癌因子及預后標志物的作用[20]。hsa_circ_001569在HCC癌組織中高表達，高表達水平與較大腫瘤直徑、較晚TNM分期及較差預后密切相關，其通過分子海綿機制結合miR-411-5p和miR-432-5p，促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉移[21]。在診斷方面，也發現了多個circRNA[22,23]在血液中的表達具有較高的敏感度和特異度，提示circRNA具有早期診斷的臨床應用價值。

本研究中，hsa_circ_0008934在有門靜脈侵犯的HCC癌組織中高表達，并且癌組織中hsa_circ_0008934表達水平顯著高于癌旁組織，其高表達與較大的腫瘤直徑、較高的AFP及較低的組織分化程度顯著相關，表明hsa_circ_0008934可能在HCC的疾病發展過程中發揮重要作用。

我們通過ROC曲線分析，發現hsa_circ_0008934具有較好的診斷價值，具有成為一種新的HCC生物學標志物的潛能。預后分析發現，hsa_circ_0008934低表達患者的OS顯著長于高表達者，單因素及多因素預后分析發現，hsa_circ_0008934表達與TNM分期是影響預后的獨立危險因素。因此hsa_circ_0008934可作為HCC診斷和預后評估的生物學標志物。

綜上所述，hsa_circ_0008934在HCC癌組織中高表達，其高表達與較大腫瘤直徑、較高AFP、較低組織分化程度及較差預后密切相關，hsa_circ_0008934可作為一種新的生物學標志物用于HCC的診斷和預后評估。