碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的分布及耐藥性分析*

宋 靜，戎建榮

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030051；2.山西大醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西太原 030032)

肺炎克雷伯菌是一種常見的腸桿菌科細(xì)菌，可引起醫(yī)院感染，是一種條件性病原體。當(dāng)身體的免疫功能下降時(shí)，細(xì)菌會(huì)在肺部、泌尿道等許多部位引起感染[1]。碳青霉烯類抗菌藥物作為臨床治療腸桿菌科細(xì)菌引起感染的重要藥物，近年來(lái)，隨著這些藥物的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)已經(jīng)出現(xiàn)在世界各地，檢出量逐年上升，引起醫(yī)療界的廣泛關(guān)注[2]。

本研究以山西大醫(yī)院臨床分離的CRKP菌株為研究對(duì)象，探討其臨床分布及耐藥性。為臨床針對(duì)不同酶型用藥，控制產(chǎn)酶菌株提供理論依據(jù)。同時(shí)，采用2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦的改良碳青霉烯類滅活實(shí)驗(yàn)(mCIM)對(duì)碳青霉烯酶進(jìn)行篩選[3]，并探討其在檢測(cè)CRKP中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2018年1月至2019年1月山西大醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室檢出的41株CRKP，排除同一患者重復(fù)分離的菌株。質(zhì)量控制菌株ATCC 25922、ATCC 1705、ATCC 1706。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 使用法國(guó)VITEK-2自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)最新參考標(biāo)準(zhǔn)判斷折點(diǎn)；紙片擴(kuò)散法用于藥敏試驗(yàn)結(jié)果的補(bǔ)充。

1.2.2mCIM 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)M100-S27文件推薦方法[3]，取過(guò)夜培養(yǎng)純菌落1 μL接種環(huán)滿環(huán)，置于2 mL TSB培養(yǎng)基中，并充分搖動(dòng)。將10 μg美羅培南紙片浸入細(xì)菌懸浮液中，并在大氣條件下于(35±2)℃溫育(4±0.25)h。在溫育快要結(jié)束時(shí)，制備大腸桿菌ATCC 25922懸浮液(0.5麥?zhǔn)蠞岫?并在M-H瓊脂平板上均勻涂布。將過(guò)量藥敏紙片上的細(xì)菌溶液擠出并用無(wú)菌鑷子貼在上述M-H瓊脂平板上，在35 ℃下孵育18～24 h以測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.2.3基因檢測(cè) 加熱煮沸法制備DNA模板，PCR擴(kuò)增KPC、GES、IMP-1、GIM[4]、NDM、VIM、SPM、OXA-48[5]基因序列。放置在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，觀察UV燈下的PCR產(chǎn)物。見表1。

表1 耐藥基因引物序列

1.2.4DNA測(cè)序 PCR產(chǎn)物由北京賽默飛公司完成測(cè)序，根據(jù)所測(cè)序列與GenBank中BLAST程序中的序列比對(duì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本來(lái)源 分離出41株CPKP菌株，其中13株來(lái)源于痰標(biāo)本，占31.71%，見表2。

表2 41株CPKP菌株的來(lái)源和比例

2.2科室分布 重癥醫(yī)學(xué)科構(gòu)成比較高，占24.39%，其次為普通外科，占21.95%。不同科室CRKP的分布，見表3。

表3 CPKP菌株的分布及比例

2.3CPKP菌株的藥敏分析 41株CRKP分離株對(duì)常用藥物的耐藥性均在90%以上。對(duì)氨基糖苷類藥物慶大霉素、頭孢菌素類(3代、4代)抗菌藥物，青霉素或3代頭孢菌素和酶抑制劑(阿莫西林/棒酸、哌拉西林/他唑巴坦)的組合顯示出更高的耐藥率，替加環(huán)素顯示出較低的耐藥率，見表4。

表4 CPKP菌株的藥敏分析

續(xù)表4 CPKP菌株的藥敏分析

2.4表型實(shí)驗(yàn)與分子學(xué)方法比較 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0與PCR檢測(cè)方法行一致性檢驗(yàn)，Kappa=0.48，一致性程度尚可，靈敏度95%、特異度100%。

2.5基因檢測(cè) 41株產(chǎn)碳青霉烯酶菌株進(jìn)行測(cè)序，40株攜帶KPC基因。其中，1株菌同時(shí)攜帶KPC和NDM基因，1株攜帶NDM基因，剩余耐藥基因?yàn)殛幮浴?/p>

3 討 論

本研究顯示，分離的CRKP主要來(lái)源于重癥醫(yī)學(xué)科(24.39%)和普通外科(21.95%)，標(biāo)本類型主要為痰(31.71%)、尿液(19.51%)和血液(19.51%)，可能與該科室中患者存在基礎(chǔ)疾病重、住院時(shí)間長(zhǎng)，抗菌藥物使用不規(guī)范、常進(jìn)行侵入性診療等有關(guān)[6-7]。因此，對(duì)于此類科室，應(yīng)該嚴(yán)格落實(shí)醫(yī)院感染控制相關(guān)措施，積極隔離CRKP感染的患者，盡可能阻斷交叉?zhèn)鞑ネ緩?，以降低CRKP的感染率。

CRKP治療臨床感染的主要原因是碳青霉烯酶的產(chǎn)生[8-10]。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，可以分為A類、B類和D類。A類，最常見的是KPC型，是絲氨酸酶；B類以NDM、VIM及IMP型更常見，發(fā)揮活性需要金屬離子參與；D類碳青霉烯酶為OXA-23，OXA-48型等。在本研究中，mCIM測(cè)定法用于檢測(cè)耐藥菌株是否產(chǎn)生碳青霉烯酶，檢測(cè)靈敏度95%，特異度100%，靈敏度低的原因可能為同時(shí)合并產(chǎn)AmpC酶、外排泵的高表達(dá)等其他耐藥機(jī)制[11]。KPC型為主要的酶類型，且這類菌株往往表現(xiàn)出高水平耐藥，可選擇藥物較少，因此一旦出現(xiàn)這類細(xì)菌，臨床將會(huì)面對(duì)一個(gè)非常棘手的問(wèn)題。此外，編碼KPC型酶的編碼基因常常通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)，因此很容易在不同種屬細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移和傳播[12]。同時(shí)，還有1株菌株同時(shí)攜帶KPC和NDM基因，1株菌株攜帶NDM型，這類菌株對(duì)多黏菌素和替加環(huán)素以外的抗菌藥物具有泛耐藥特性[13]，也應(yīng)該引起臨床足夠的重視。

總之，本院CRKP的耐藥率超過(guò)90%，主要集中在重癥監(jiān)護(hù)病房。KPC型的碳青霉烯酶的產(chǎn)生是CRKP耐藥的主要原因，需引起醫(yī)務(wù)人員的關(guān)注。mCIM作為篩選碳青霉烯酶表型方法，可以準(zhǔn)確、及時(shí)地用于產(chǎn)酶菌株的篩選，為臨床醫(yī)生進(jìn)行個(gè)體化治療提供依據(jù)，同時(shí)協(xié)助醫(yī)院感控部門控制CRKP的傳播及暴發(fā)。