肺炎克雷伯菌強毒性血清型分型與ESBLs檢測*

馬 青，劉 英，王 月，李世軍

(貴州省疾病預防控制中心，貴州貴陽 550004)

肺炎克雷伯菌是一種臨床常見的條件致病菌之一，為革蘭陰性菌，寄居于人體的呼吸道(鼻咽部)、腸道、皮膚等部位，可引起多種感染，在各類臨床標本中均有較高的檢出率。該菌在健康者口咽部的帶菌率為1%～6%，但在住院患者中可高達20%。毒力與耐藥性是影響細菌致病性的2個重要因素，在感染中發揮重要作用。本研究收集了從2010年9月至2019年6月“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項的貴陽市5家哨點醫院(貴陽市第一人民醫院、貴陽市第五人民醫院、貴陽市肺科醫院、清鎮市人民醫院和修文縣人民醫院)發熱呼吸道綜合征患者的痰標本分離到的17株肺炎克雷伯菌株，對其進行強毒性血清型分型及產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 17株肺炎克雷伯菌株分離自2010年9月至2019年6月“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項的貴陽市5家哨點醫院的發熱呼吸道綜合征患者的痰標本。ESBLs表型確證試驗質控菌株：肺炎克雷伯菌菌株ATCC 700603。

1.2儀器與試劑 PCR擴增引物購自中國北京天一輝遠公司；PCR擴增試劑2×Taq Plus PCR Master Mix、DNA標志物及瓊脂糖等電泳試劑購自中國遼寧大連寶生物公司；標準抗菌藥物藥敏紙片購自英國Oxoid公司。

1.3方法

1.3.1黏液絲試驗 平板培養物挑起的黏液絲長度≥5 mm判為黏液絲試驗陽性，需挑起2～3次以確認菌株是否為高黏液表型[1]。

1.3.2DNA模板的制備 水煮法制備DNA模板，100 ℃煮10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板，-20 ℃放置備用。

1.3.3多重PCR擴增主要流行高毒力血清型 檢測國內主要流行的K1、K2、K5、K20、K54、K57毒力血清型基因。多重PCR 擴增反應體系50 μL，內含 Taqmix 25 μL，12條引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，去離子水18 μL。擴增參數：95 ℃預變性15 min ；94 ℃ 30 s、58 ℃ 90 s、72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳后根據電泳條帶大小判斷血清型[2]。各血清型引物序列和產物大小見表1。

1.3.4ESBLs檢測 應用美國臨床和實驗室標準協會推薦的ESBLs表型確證試驗對肺炎克雷伯菌株進行檢測，同時用大腸埃希菌ATCC 25922進行質控。將待測菌制成濁度為0.5麥氏單位的菌懸液，用無菌棉棒均勻涂布于M-H平皿上，把頭孢他啶(30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(30 μg/10 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(30 μg/10 μg)藥敏紙片貼在平皿上35 ℃孵育18～24 h后觀察結果。檢測結果按美國臨床和實驗室標準協會判定標準進行判定各平皿上的抑圈直徑，抑菌圈直徑≥5 mm為產酶株，即ESBLs陽性[3]。

表1 肺炎克雷伯菌高毒力血清型PCR血清分型引物序列和引物大小

2 結 果

2.1黏液絲試驗 17株肺炎克雷伯菌株中有8株黏液絲試驗陽性，為高黏液表型。

2.2強毒性血清型肺炎克雷伯菌的檢出結果 強毒性血清型肺炎克雷伯菌檢出率占52.94%(9/17)，其中K1型是主要的流行型別，占47.06%(8/17)； K2型有1株。17株肺炎克雷伯菌各血清型DNA擴增結果見圖1。

2.3ESBLs檢測 17株肺炎克雷伯菌的ESBLs檢出率不高，僅有1株檢出ESBLs表型確證試驗陽性，此菌株強毒性血清分型結果為K1型，且黏液絲試驗為陰性。見圖1。

注:M表示DNA標準帶；1～17表示17株肺炎克雷伯菌各血清型DNA擴增結果；18表示陰性對照。

圖1 肺炎克雷伯菌強毒性血清分型多重PCR電泳結果

3 討 論

肺炎克雷伯菌作為一種人畜共患的病原菌，廣泛分布于自然界，是人和動物呼吸道、腸道的致病菌。肺炎克雷伯菌具有K抗原(莢膜多糖)和O抗原(脂多糖)，其中莢膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子之一，根據莢膜多糖結構及其抗原性不同，可將肺炎克雷伯菌分為82個莢膜血清型[4]。其中K1、K2、K5、K20、K54、K57等與人類各種侵襲性感染密切相關，為強毒性血清型肺炎克雷伯菌[5-7]。高毒力肺炎克雷伯菌的生物學特征及臨床致病能力與普通肺炎克雷伯菌不同，可引起肺炎、泌尿感染、敗血癥、肝膿腫等一系列社區獲得性疾病。相關報道顯示，肺炎克雷伯菌K1、K2型菌株與社區獲得性肝膿腫的發生有密切聯系[8]。一項研究發現，K1型是導致肺炎克雷伯菌菌血癥最常見的血清型，K2型是呼吸道標本中最常見的血清型[9]。但本研究發現痰標本中強毒性肺炎克雷伯菌最多的血清型別為K1型而非K2型，可能存在地區差異。

高毒力和耐藥在過去的三十年間被認為不會在同一株肺炎克雷伯菌上表達，但目前在全球范圍內強毒性肺炎克雷伯菌獲得性耐藥的情況日益增加[10]。本研究中有1株K1型肺炎克雷伯菌在不具高黏液表型的條件下產ESBLs，提示對臨床癥狀符合強毒性肺炎克雷伯菌感染特性但黏液絲實驗陰性的菌株也應警惕，避免根據黏液表型對肺炎克雷伯菌進行分類，可能會出現強毒性肺炎克雷伯菌漏檢的情況。此株產ESBLs的K1型肺炎克雷伯菌分離自一位臨床診斷為重癥肺炎的死亡病例，提示對既產ESBLs同時又具高毒力的肺炎克雷伯菌在臨床上應高度重視。本研究發現8株黏液絲試驗陽性的肺炎克雷伯菌株中有1株不屬于強毒性血清型，9株強毒性血清型菌株中有2株不具有高黏性，這表明并非所有的強毒性肺炎克雷伯菌都具有高黏性，也并非所有高黏性的肺炎克雷伯菌都具有高毒力。

本研究分析了肺炎克雷伯菌臨床分離株的生化和分子特征，提示實驗室應注意檢測肺炎克雷伯菌黏液性狀、莢膜血清型和產ESBLs情況，從而幫助臨床醫生正確識別高致病性肺炎克雷伯菌導致的感染。目前高致病性肺炎克雷伯菌分離率較高，其耐藥株的暴發可能會導致極高的病死率，因此臨床上應及時進行監控和干預。雖然本研究檢出產ESBLs肺炎克雷伯菌株只有1株，但隨著抗菌藥物的廣泛應用，臨床上檢出產ESBLs的細菌呈逐年上升趨勢的情況不容忽視。