應用抗Xa活性測定肝素、低分子肝素及利伐沙班的性能驗證

付 璐，李 潔，董麗梅，畢 莉，王 穎，劉明明，李 琳，吳 悅，關 雨

(哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院實驗診斷教研室，黑龍江哈爾濱 150001)

隨著肝素、低分子肝素(LMWH)及利伐沙班的廣泛應用，對于部分患者的血漿肝素、LMWH及利伐沙班的藥物水平進行必要的監測，可以在提高抗凝效果的同時降低患者出血的風險。CS5100全自動血凝儀(簡稱CS5100)應用發色底物法檢測肝素抗Xa活性，其原理是將標本中的肝素等藥物與抗凝血酶(AT)形成復合物，此復合物與過量添加的Xa因子相結合，并滅活與之結合的Xa活性。剩余的Xa因子活性的測量，是通過檢測其特異的底物作用而釋放出pNA的量來進行的，這一反應中最終檢測到pNA的量與患者血液中肝素等藥物的水平成反比，從而實現應用抗Xa活性定標血漿肝素、LMWH及利伐沙班水平。本文參考美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)H57-A、H26-A2和EP17-A2文件、衛生行業標準WS/T406-2012及試劑生產廠家的試劑說明書作為依據[1-5]，對CS5100檢測血漿肝素、LMWH及利伐沙班水平的性能進行驗證。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選取在本院就診的體檢健康者，參照CLSI H21-A5文件的要求[6]，用0.109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管采集靜脈血3 mL，1 500 r/min離心10 min，分離出乏血小板血漿，要求標本無溶血、凝固、乳糜現象，血細胞比容<55%。

1.2儀器與試劑 CS5100全自動血凝儀購自日本Sysmex公司；抗-Xa活性測定試劑盒(發色底物法)購自中國上海貞元診斷用品科技有限公司，批號為20181101。肝素校準品批號為20190201，質控品批號為20190201；LMWH校準品批號為20190301，質控品批號為20190301；利伐沙班校準品批號為20190301，質控品批號為20190301。

1.3方法

1.3.2準確度或可比性驗證 參照廠家提供的定值質控品使用說明書，使用1 mL的蒸餾水將正常和異常2個水平的定值質控品進行復溶、混勻，室溫(25±2)℃穩定20～30 min后進行檢測。同時參照CLSI EP15-A2文件要求[7]，重復測定血漿肝素、LMWH及利伐沙班2個水平的定值質控品各3次，將測定值與靶值進行比較，計算相對偏倚，相對偏倚=(靶值-測定值)/靶值×100%。查閱Westgard生物學CV要求，偏倚±15%。

判定標準：(1)肝素在0.10～1.20 IU/mL線性范圍內，線性相關系數(r)≥0.990；在0.10～0.25 IU/mL線性范圍內，線性絕對偏差不超過±0.05 IU/mL；在0.26～1.20 IU/mL線性范圍內，線性絕對偏差不超過±15%。(2)LMWH在0.10～1.60 IU/mL線性范圍內，r≥0.990；在0.10～0.30 IU/mL線性范圍內，線性絕對偏差不超過±0.05 IU/mL；在0.31～1.60 IU/mL線性范圍內，線性絕對偏差不超過±15%。(3)利伐沙班由于目前沒有相關的要求，此標準參照肝素與LMWH定為線性絕對偏差不超過±15%。計算Y=aX+b，驗證線性范圍，a值在1±0.05范圍內，r≥0.990。

1.3.4參考區間驗證 廠家試劑說明書提供的參考區間肝素及LMWH均為0。參照CLSI C28-A2文件[8]，收集20名體檢健康者血漿，排除伴有血液系統疾病、心腦血管疾病、肝臟疾病、肺栓塞、使用肝素等抗凝藥物者。進行血漿肝素及LMWH水平的檢測。評價標準:體檢健康者血漿肝素及LMWH水平接近于0，結果符合率>90%。

1.4統計學處理 采用Excel2003軟件進行數據統計分析。

2 結 果

2.1精密度驗證 血漿肝素與LMWH水平批內不精密度和日間不精密度驗證結果均符合試劑說明書要求。見表1。

2.2準確度驗證 血漿肝素和LMWH各項目檢測結果均落在質控品標示的允許范圍內，偏倚符合Westgard生物學CV要求。見表2。

表1 肝素、LMWH、利伐沙班-抗Xa活性檢測批內與日間精密度驗證結果

表2 肝素、LMWH、利伐沙班抗Xa活性檢測準確度驗證

2.3線性驗證 用試劑配套稀釋液與高值混合血漿按比例稀釋的LMWH線性驗證其理論值與實測值的回歸方程為Y=0.749 5X+0.252 9，r=0.984。不符合判定標準，驗證不合格。用體檢健康者混合血漿作稀釋液與高值混合血漿按比例稀釋的肝素線性驗證其理論值與實測值的回歸方程為Y=0.996 1X+0.007，r=0.999；線性在0.10～0.25 IU/mL時，線性偏差未超過±0.05 IU/mL；在0.26～1.20 IU/mL時，線性絕對偏差也均未超過±15%，均符合判定標準，驗證合格。用體檢健康者混合血漿作稀釋液與高值混合血漿按比例稀釋的LMWH線性驗證其理論值與實測值的回歸方程為Y=0.982 3X+0.017 4，r=0.996；線性在0.10～0.30 IU/mL時，線性偏差未超過±0.05 IU/mL；在0.30～1.60 IU/mL時，線性絕對偏差均未超過±15%。均符合判定標準，驗證合格。見表3。

表3 肝素、LMWH、利伐沙班抗Xa活性檢測的線性驗證

續表3 肝素、LMWH、利伐沙班抗Xa活性檢測的線性驗證

注:a表示應用試劑配套稀釋液；b表示應用體檢健康者混合血漿稀釋；-表示此項無數據。

2.5攜帶污染試驗 肝素高值對低值的污染所引起的相對偏差為2.17%，低值對高值的污染所引起的相對偏差為-4.50%。LMWH高值對低值的污染所引起的相對偏差為0.26%，低值對高值的污染所引起的相對偏差為-2.34%。攜帶污染率可接受。利伐沙班高值對低值的污染所引起的相對偏差為-0.30%，低值對高值的污染所引起的相對偏差為1.09%。見表4。

表4 肝素、LMWH及利伐沙班高低值樣本的攜帶污染率

3 討 論

肝素、LMWH及利伐沙班目前廣泛用于治療和預防各種血栓性疾病[11-14]。應用過程中，血栓出血等各類并發癥也屢見不鮮[15-16]。目前，有研究和指南認為，對特定患者如年老者、肥胖者、孕婦、兒童和腎功不全患者的肝素、LMWH及利伐沙班進行血漿水平的監測，是提高抗凝效果、降低出血并發癥的必要手段[17]。

本研究參考CLSI系列指南文件進行性能驗證。結果顯示血漿肝素、LMWH、利伐沙班水平的批內精密度和日間精密度均符合廠家要求(批內精密度應≤8%，日間精密度≤10%)。分別應用2個水平的定標血漿對血漿肝素、LMWH、利伐沙班水平的準確度進行驗證，所有檢測結果與定標值之間的偏差均小于±15%，符合廠家說明書的要求。

在線性范圍驗證中，以廠家配套稀釋液與高值定標血漿混合的LMWHr不符合廠家說明書的要求，驗證未通過。而用體檢健康者混合血漿與高值定標血漿混合的血漿肝素、LMWH、利伐沙班r均符合廠家說明書的要求，驗證通過。回顧原因可能是因為無論是肝素、LMWH還是利伐沙班，均在AT充足的條件下才能發揮抑制Xa因子活性，起到抗凝的作用。而本試劑盒的檢測原理更是通過加入過量的Xa，來檢測未被抑制活性的Xa數量，反過來推算血漿中的各種藥物水平。當使用稀釋液對高值血漿進行倍比稀釋時，不能給試驗補充相應的AT，造成檢測的結果均低于理論值。體檢健康者混合血漿在對高值血漿進行倍比稀釋時，可以補充足夠的AT，試驗中各種藥物可以被充分激活，所以檢測值與理論值非常接近。盡管CS5100在血漿肝素、LMWH、利伐沙班的檢測中自帶各種倍數的稀釋程序，但是需要使用稀釋液進行稀釋，檢測結果無法反映真實的血漿水平，所以不能啟用稀釋程序。當血漿水平超過最大檢出限時，要使用體檢健康者混合血漿手工稀釋后，進行上機檢測。

參考區間驗證中，20名體檢健康者肝素、LMWH及利伐沙班的血漿水平均為0.00 IU/mL，結果通過率為100%。攜帶污染也均低于相關血凝儀性能驗證文獻報道的各項目CV<10%[9-10]，符合要求。

4 結 論

綜上所述，本研究對CS5100全自動血凝儀進行肝素、LMWH及利伐沙班的血漿水平進行了性能驗證，結果符合廠家和衛生行業標準的要求。但在應用時要注意要使用體檢健康者血漿作為稀釋血液進行線性的調整。同時，目前國內外對于通過測定抗Xa活性進行各種肝素類藥物水平的檢測，尚無性能驗證和質量控制方面的指南性文件。期望相關指南的完善，能使肝素、LMWH及利伐沙班的血漿水平進一步規范化開展，提高檢測質量。