高速離心方案對(duì)乙型肝炎病毒回收效果分析*

劉 曉，歐國(guó)進(jìn)，劉 忠△

(1.德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川德陽 618000；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所，四川成都 610052)

從核酸檢測(cè)開始推行后，乙型肝炎病毒(HBV)的傳播風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)大大降低[1]，但該檢測(cè)方法不能100%阻斷HBV經(jīng)血傳播，原因之一為核酸檢測(cè)試劑與免疫學(xué)檢測(cè)方法一樣有自己的檢測(cè)下限，大多數(shù)HBV核酸檢測(cè)試劑的靈敏度在28 copy/mL以上，當(dāng)病毒水平低于該檢測(cè)下限時(shí)，如隱匿性乙型肝炎感染或病毒感染窗口期，病毒水平通常<112 copy/mL，隱匿性乙型肝炎感染標(biāo)本的平均載量為78.4 copy/mL，但有時(shí)病毒載量低于28 copy/mL[1]，這時(shí)核酸檢測(cè)就可能出現(xiàn)漏檢。目前報(bào)道的輸血傳播疾病的殘余風(fēng)險(xiǎn)主要還是輸血感染HBV[3-4]。窗口期及隱匿性感染已經(jīng)成為阻礙血液安全推進(jìn)的主要瓶頸。另一方面，由于核酸檢測(cè)成本昂貴，為了降低成本，目前的檢測(cè)中心大都使用多人份混檢[6-8]，HBV核酸混樣檢測(cè)策略因單個(gè)取樣量變少而不能確保發(fā)現(xiàn)所有的低載量窗口期感染標(biāo)本。如果在獻(xiàn)血者的篩查中未檢測(cè)出這種極低水平的病毒滴度，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果[9]，已有報(bào)道稱因輸注了未能檢測(cè)到HBV-DNA的血液而感染HBV[10]。為了解決該問題，有研究者提出了病毒濃縮，即在多人份混檢(也可用于單檢)情況下，加大單個(gè)標(biāo)本取樣量，然后運(yùn)用離心技術(shù)將HBV病毒沉淀下來，提高病毒水平，從而提高檢測(cè)靈敏度。但目前報(bào)道的離心力從(15 000～266 000)×g不等[11-12]，離心時(shí)間也各不相同，這就導(dǎo)致了病毒回收差異大，不能準(zhǔn)確提供離心力及離心時(shí)間與HBV回收率的關(guān)系。本文就以上問題，研究離心力與離心時(shí)間對(duì)HBV回收率的影響，為大家提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 HBV標(biāo)準(zhǔn)品為定量標(biāo)準(zhǔn)品S1、S2、S3，定量值分別為1.65×108、2.58×107、1.37×106copy/mL。混樣所用陰性標(biāo)本為德陽市血液中心提供的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶異常的報(bào)廢血，實(shí)驗(yàn)室經(jīng)核酸檢測(cè)HBV、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒均為陰性，同時(shí)其乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗體、人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒抗體也均為陰性。所有標(biāo)本于-20 ℃保存。

1.2儀器與試劑 病毒總核酸提取試劑盒購自德國(guó)Qiagen公司，貨號(hào)51106；超高速離心機(jī)及超高速離心管購自美國(guó)貝克曼公司；小量核酸提取儀購自美國(guó)Thermo公司；熒光定量PCR儀購自美國(guó)ABI公司，型號(hào)7900HT；HBV標(biāo)準(zhǔn)品購自中國(guó)北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司。

1.3方法 取4個(gè)容量為1 L的玻璃瓶，洗凈烘干泡酸后進(jìn)行高壓滅菌處理，待冷卻后每瓶加入900 mL的陰性血漿，然后再加入650 μL的S3 HBV標(biāo)準(zhǔn)品(水平為1.37×106copy/mL)，上下顛倒充分混勻(不少于20次)制成原倍血漿。此時(shí)，每瓶HBV理論水平為985.6 copy/mL。將混勻的HBV標(biāo)本用無菌一次性注射器分裝至264個(gè)離心管中，每管分裝13 mL(理論容量為13.5 mL)，經(jīng)稱量平衡后將管口密封。另取6個(gè)離心管只分裝陰性血漿，作為陰性對(duì)照，共270管。

1.3.1離心力與離心時(shí)間的雙因素交互分析設(shè)計(jì) 將264個(gè)陽性離心管按離心力(15 000～171 000)×g與離心時(shí)間0.5～2.0 h分成44組，每組做6個(gè)平行管。每組按相應(yīng)條件進(jìn)行4 ℃低溫高速離心，離心后棄上清留病毒沉淀，沉淀用200 μL的磷酸鹽緩沖液吹打混勻，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，準(zhǔn)備后續(xù)提取及擴(kuò)增檢測(cè)(若不能及時(shí)進(jìn)行提取，可于-20 ℃保存)。6個(gè)陰性對(duì)照隨機(jī)與實(shí)驗(yàn)組一同處理。另取6個(gè)離心管，每管取200 μL的原倍血漿作為原始水平對(duì)照，與離心處理后的標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行提取、擴(kuò)增、檢測(cè)。計(jì)算離心濃縮后的病毒水平及回收率。

1.3.2HBV-DNA提取 對(duì)含200 μL原倍血漿或經(jīng)離心處理后的200 μL的濃縮液進(jìn)行提取，提取使用凱杰過柱法，同時(shí)提取5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，提取用量為200 μL。

1.3.3HBV-DNA擴(kuò)增及檢測(cè) 使用實(shí)驗(yàn)室HBV熒光定量檢測(cè)方法，HBV上游引物:5′-ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC-3′,下游引物:5′-ACA MAC GGG CAA CAT ACC TT-3′。探針:FAM-CAT CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CT-HBQ。25 μL反應(yīng)體系:2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物各0.5 μL，探針0.4 μL，DNA模板 4 μL，雙蒸水7.1 μL，采用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。程序設(shè)置:95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)，熒光收集在60 ℃。

1.3.4引入高速離心濃縮技術(shù)后的靈敏度驗(yàn)證 取S3標(biāo)準(zhǔn)品分別制備成11.2 copy/mL及5.6 copy/mL的HBV標(biāo)準(zhǔn)品。取8個(gè)超高速離心管，每管加入2 mL的11.2 copy/mL的血漿，然后用陰性血漿加滿離心管，另取8個(gè)離心管，每管加入4 mL的5.6 copy/mL的血漿，然后用陰性血漿加滿離心管。再取2個(gè)離心管分裝陰性血漿，作為陰性對(duì)照。稱量配平后封管，107 000×g離心1 h后棄上清，重懸沉淀，200 μL溶液提取DNA，步驟同1.3.2。HBV擴(kuò)增及檢測(cè)同步驟1.3.3。另各取2份200 μL的未離心原標(biāo)本與離心后標(biāo)本一同提取DNA及后續(xù)擴(kuò)增檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 該結(jié)果所有數(shù)據(jù)均由SPSS12.0軟件進(jìn)行處理，各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì),采用t檢驗(yàn)和雙因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同高速離心方案的檢測(cè)結(jié)果及回收率 陰性對(duì)照管檢測(cè)結(jié)果均為陰性。HBV原倍血漿檢測(cè)結(jié)果的均值為941.36 copy/mL(理論水平為985.6 copy/mL)，回收率為95.5%。見表1、圖1。

2.2離心時(shí)間對(duì)HBV回收率的影響 經(jīng)SPSS12.0軟件分析，P=0.352，不拒絕原假設(shè)，認(rèn)為時(shí)間對(duì)回收率沒有明顯影響。即在任意固定的離心力下，離心時(shí)間的差異對(duì)病毒回收影響不大。

表1 不同離心力與離心時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果(copy/mL)

圖1 不同離心時(shí)間、離心力下的HBV回收率

2.3離心力對(duì)HBV回收率的影響 經(jīng)SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，P=0.000，拒絕原假設(shè)，認(rèn)為離心力對(duì)回收率有明顯影響。(15 000～90 800)×g之間任意2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即在這個(gè)范圍內(nèi)，HBV回收率隨著離心力的增加而增加，回收率在(41.4±7.5)%～(83.8±9.5)%。離心力在(908 00～171 000)×g，任意2組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即在這個(gè)范圍內(nèi)，回收率相對(duì)穩(wěn)定，達(dá)71.6%～102.9%。

表2 低載量標(biāo)本高速離心處理后定量結(jié)果

注:A表示HBV水平為5.6 copy/mL的擴(kuò)增曲線；B表示HBV水平為11.2 copy/mL的擴(kuò)增曲線。

圖2 高速離心后的效果驗(yàn)證

2.4離心力、離心時(shí)間的交互作用對(duì)HBV回收率的影響 經(jīng)SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析(雙因素交互方差分析)，該結(jié)果P=1.000，不拒接原假設(shè)，無證據(jù)表明交互作用對(duì)回收率有顯著影響，即說明這2個(gè)因素是相互獨(dú)立的，沒有交互作用。

2.5高速離心處理低載量標(biāo)本后的效果驗(yàn)證 離心條件:107 000×g，4 ℃離心1 h。陰性對(duì)照均無擴(kuò)增曲線，未離心原標(biāo)本均未檢出，見表2、圖2。

3 討 論

中國(guó)是乙型肝炎大國(guó)，嚴(yán)重威脅到血液安全。在HBV感染的“窗口期”、免疫靜默感染、隱匿性感染及自限性感染末期的攜帶者可能出現(xiàn)極低水平的HBV-DNA，低水平HBV-DNA的患者體內(nèi)可能存在著肝臟的持續(xù)性損傷和病毒復(fù)制，一旦發(fā)生漏檢就會(huì)嚴(yán)重影響臨床診治和輸血安全，應(yīng)引起高度重視。這時(shí)想要準(zhǔn)確檢測(cè)到病毒載量，不僅與靈敏度高的檢測(cè)試劑有關(guān)，還與取樣概率有關(guān)，因?yàn)镠BV病毒在人體中呈現(xiàn)泊松分布[2,13]，如果取樣量過低，就會(huì)出現(xiàn)假陰性情況，尤其是在多人份混檢時(shí)(相當(dāng)于將標(biāo)本稀釋)，這種情況更加明顯。

本文基于已報(bào)道過的離心力及離心時(shí)間，通過一系列的離心力及離心時(shí)間來研究HBV回收率及其關(guān)系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，離心力是影響回收率的最大因素，當(dāng)離心力在(15 000～908 00)×g時(shí)，隨著離心力的增加，回收率也從41.4%上升到83.8%，且各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而后隨著離心力在一定范圍內(nèi)[(90 800～171 000)×g]增加，病毒回收率相對(duì)恒定，維持在82.5%～87.9%，各組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)離心力過大時(shí)(171 000×g)，回收率有下降趨勢(shì)，可能原因是離心力過大，沉淀物與管壁黏附較牢固，洗脫不充分，導(dǎo)致回收率下降。又或是離心力大而沉淀了過多的雜質(zhì)，抑制了檢測(cè)步驟中熒光定量PCR的反應(yīng)，不排除操作誤差導(dǎo)致了數(shù)據(jù)的偏差。離心時(shí)間、離心力與時(shí)間交互作用對(duì)回收率影響不大，實(shí)際工作中考慮到時(shí)間效益，可以選擇0.5 h的離心時(shí)間。

按本次實(shí)驗(yàn)中的80%回收率計(jì)算，當(dāng)進(jìn)行n(n≥2)倍離心濃縮時(shí)，則病毒水平提高0.8n倍，即可以提高檢測(cè)試劑盒的靈敏度0.8n倍。例如試劑盒的靈敏度為224 copy/mL，而標(biāo)本HBV水平為28 copy/mL，進(jìn)行10倍濃縮時(shí)(若不進(jìn)行離心濃縮，將可能出現(xiàn)漏檢)，標(biāo)本水平可提高至224 copy/mL，從而達(dá)到檢測(cè)試劑盒的靈敏度(相當(dāng)于試劑盒檢出下限可達(dá)28 copy/mL)，可以減少因試劑盒靈敏度不夠而導(dǎo)致的漏檢。為了驗(yàn)證該結(jié)論，筆者將HBV標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至11.2 copy/mL、5.6 copy/mL，按80%的回收率計(jì)算，則11.2 copy/mL的標(biāo)本需進(jìn)行10倍濃縮，即將取樣量增加至2 mL，才能達(dá)到本實(shí)驗(yàn)室HBV檢測(cè)試劑的靈敏度(90.72 copy/mL)，對(duì)應(yīng)的5.6 copy/mL的標(biāo)本需20倍濃縮，即4 mL取樣量，然后經(jīng)超高速離心(90 800～171 000)×g 1 h后檢測(cè)標(biāo)本。結(jié)果顯示檢出率均為100%。

目前國(guó)內(nèi)有一些關(guān)于HBV濃縮的文章,1篇在20 000×g離心30 min時(shí)的濃縮效率高達(dá)90%以上[12]，與本文差距較大，原因?yàn)樵撐闹惺褂昧司垡叶紳饪s劑，其可以減少病毒分子間距，使其快速沉淀下來，大大增加了濃縮效率，但該法加入外來試劑，易引起污染，且聚乙二醇試劑加入量為總?cè)萘康?0%，這樣不能處理多混樣的大容量標(biāo)本。而其他研究中，24 600×g離心1 h時(shí)HBV的回收率在40%～90%[13-14]，回收差異大，而且使用的離心機(jī)為高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，一次只能處理小容量的標(biāo)本，并不適用于大容量標(biāo)本濃縮。本法不需要加入外來試劑，有效避免污染，且適用于大容量標(biāo)本或者多標(biāo)本的處理。

4 結(jié) 論

高速離心技術(shù)可使HBV檢出率提高，通過適當(dāng)增加標(biāo)本量，可檢出低至5.6～11.2 copy/mL甚至更低的HBV病毒載量。