1 664例不孕癥女性人乳頭瘤病毒感染基因亞型分析*

曾青紅，周志輝，李梅芳，姚 丹，羅 露，曹 敏

(湖南省婦幼保健院檢驗科，湖南長沙 410008)

人乳頭瘤病毒(HPV)是一種小的球形環狀雙鏈DNA病毒，能特異性地引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖，可導致多種良、惡性病變，感染途徑通常是性傳播。有研究表明，女性不孕癥可能與高危型HPV感染有關，國內一些研究報道了不同地區的不孕癥女性HPV感染的情況[1-3]，已發現的HPV具有近200種亞型，但由于地理環境、人文面貌的不同，HPV感染的基因型別分布存在地域差異[4-6]。國內外已有報道不同地區的高危型HPV感染的基因分型，湖南地區也有針對普通人群的HPV篩查檢測[7-8]，但是湖南地區并未開展針對不孕癥女性HPV感染基因型別的研究。本研究采用北京博暉創新生物技術股份有限公司提供的試劑及儀器，檢測湖南地區不孕癥女性感染的HPV基因亞型，分析不孕癥女性HPV感染情況與一般人群之間的差異，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年1月至2019年7月在湖南省計劃生育研究所生殖醫學中心進行人類輔助生殖技術的不孕癥女性1 664例(不孕組)、婦科門診就診的體檢女性1 462例(對照組)的宮頸脫落細胞，人群均來自湖南省不同地區，年齡18～52歲。不孕癥者定義為有1年未避孕性生活，仍未受孕或無活產者；對照組入選標準為月經規律，已婚已育且為自然受孕。

1.2儀器與試劑 核酸芯片檢測儀購自中國北京博暉創新生物技術股份有限公司，型號BHF-VI，檢測方法采用PCR體外擴增和DNA反向斑點雜交法相結合的DNA芯片技術，檢測24種HPV核酸亞型，包括高危型HPV亞型與低危型HPV亞型，分別為:HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83型。宮頸脫落細胞采集器購自中國北京博暉創新生物技術股份有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 所有女性均在月經來潮后10～18 d采集標本，采集前3 d不做陰道沖洗，不用避孕藥膏等陰道內用藥物，不進行醋酸或碘液涂抹，采集前24 h無性行為。先以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去，取出宮頸刷置于宮頸口，單方向旋轉4～5周以獲得足量的上皮細胞標本，然后將宮頸刷頭部放入洗脫管中，沿刷柄折痕處將宮頸刷柄折斷，旋緊洗脫管蓋，做好標本標識，并保持洗脫管直立放置。標本采集后盡快送檢，當天來不及上機檢測的標本-20 ℃保存，避免反復凍融。

1.3.2標本檢測 充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干。取1 mL洗脫液轉移至1.5 mL離心管內，13 000 r/min離心10 min，棄去上清液，保留100 μL，使用移液器輕吸打3～5次，混勻待用。按照儀器說明書依次準備好儀器與試劑，手動加50 μL處理好的標本至微流控芯片加樣孔。運行HPV檢測試劑盒(生物芯片法)操作程序，依次進行核酸提取、PCR擴增、反向斑點雜交、掃描分析實驗結果。

1.3.3結果判讀 雜交膜的顯色質控探針與內參質控點都有陽性斑點，HPV探針出現陽性斑點，提示標本為該探針對應亞型陽性。雜交膜的顯色質控探針與內參質控點都有陽性斑點，HPV探針無陽性斑點出現，提示標本為該探針對應亞型陰性。

1.4統計學處理 采用Excel對數據進行統計分析，分別統計感染的亞型、不同年齡階段及感染種類(單種和多重感染)，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組HPV亞型感染情況 不孕組1 664例女性HPV總感染率為16.3%，對照組1 462例女性總感染率為15.5%，不孕組與對照組均是高危型HPV感染率最高。2組間的總感染率，低危型、高危型HPV感染率差異無統計學意義(P>0.05)。不孕組與對照組HPV多重感染率雖然差異有統計學意義(P<0.05)，但由于多重感染例數檢出少，不足以支持結果。見表1。

表1 2組中HPV亞型感染情況

注:χ2、P為2組間感染率比較的統計值。

2.22組HPV亞型分布情況 在不孕癥女性中，18種HPV高危亞型均被檢出，感染率最高的是HPV52型，其次為HPV18、51、16型，較低感染型別分別是HPV45、83、73型；6種HPV低危亞型中，HPV81型感染率最高；共檢出多重感染19例，其中四重感染1例，三重感染1例，其余為雙重感染。對照組高危HPV52型感染率最高，其次為HPV51、16、18型，較低感染型別分別是HPV35、83、73型。感染率較高的高危型HPV在不孕組與對照組中感染率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組HPV亞型分布情況

續表2 2組HPV亞型分布情況

注:-表示該項無數據；χ2、P為2組間感染率比較的統計值。

2.3不同年齡階段女性HPV感染情況 不孕組31～40歲HPV感染率低于18～30歲(χ2=13.66，P=0.000)與41～52歲女性(χ2=10.98，P=0.001)；18～30歲與41～52歲HPV感染率差異無統計學意義(χ2=0.157，P=0.692)。對照組31～40歲HPV感染率同樣低于18～30歲(χ2=15.54，P=0.000)與41～52歲女性(χ2=11.19，P=0.001)；18～30歲與41～52歲HPV感染率差異無統計學意義(χ2=0.225，P=0.635)。不孕組不同年齡段的HPV感染率與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同年齡階段女性HPV感染情況

注:χ2、P為2組間HPV檢出率比較的統計值。

3 討 論

多種因素可以引起不孕，泌尿生殖道感染是其中一個重要的因素，HPV可從生殖道逆行感染子宮、輸卵管等附件，造成慢性宮頸炎、子宮內膜炎或輸卵管形態和功能損害，導致育齡女性不孕[9-10]，但HPV感染是否為導致不孕癥的獨立因素，不同學者之間仍存在爭議。張立冬等[11]對比廣州市區不孕癥女性與體檢健康女性的HPV感染率，發現不孕癥女性HPV感染率遠高于體檢健康女性，而本研究發現在湖南地區，不孕癥女性與婦科門診女性HPV高危型和低危型單一感染率差異并無統計學意義(P>0.05)，與伍金華等[12]發現廣東江門地區不孕癥女性HPV感染率與體檢健康女性一致。另有一些研究表明，HPV多重感染會改變陰道內微環境，較單一感染，多重感染清除難度大、時間長，同時陰道正常環境的改變又容易使其他病毒、細菌、支原體、衣原體等協同感染，多重因素引起子宮、輸卵管等慢性炎癥，最終導致不孕[13-14]。本研究發現不孕組HPV多重感染率高于對照組，但由于多重感染例數檢出少，不足以支持結果，較少文獻報道HPV多重感染與不孕癥之間的直接關系，故HPV多重感染是否是造成女性不孕的獨立因素有待繼續研究。

本研究發現，湖南省不孕癥女性主要感染的類型為HPV52型，其次為HPV18、51、16型，不同于張立冬等[11]發現廣州市區不孕癥女性主要感染類型為HPV16、18、41、51型的報道，伍金華等[12]發現廣東江門地區不孕癥患者主要感染HPV52、58、16、66型及周潞等[1]發現四川地區非輸卵管不孕主要感染HPV16、53、58型，輸卵管不孕主要感染HPV58、52型的報道。這可能是由于HPV亞型分布存在地域差異。從年齡分析表明不孕組與對照組在不同年齡階段HPV感染率并無明顯差別，但不孕組和對照組在18～30歲和41～52歲的HPV感染率均高于31～40歲，且差異有統計學意義(P<0.05)，這可能是因為18～30歲人群性生活活躍，性伴侶數量為多個的概率較大，41～52歲人群自我保健意識不強，自身抵抗能力下降[15-16]。

4 結 論

不孕組女性與對照組女性HPV單一感染率無明顯差別，HPV感染率在不孕組與對照組同年齡段比較，差異無統計學意義(P>0.05)，HPV感染是否是造成女性不孕的獨立因素仍有待繼續研究。