彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者TLR4、NF-κB蛋白的表達及臨床意義*

王 蕾，劉 穎，李新霞，王新有，孫明玲，范文霞，張凱樂，王秀娟，郭新紅△

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.血液三科；2.病理科，新疆烏魯木齊 830054)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)作為一種極為常見的惡性淋巴瘤[1]，在中國的發(fā)病率約占非霍奇金淋巴瘤患者的45%[2]。DLBCL無論是在組織形態(tài)學(xué)、臨床表現(xiàn)，還是在預(yù)后上均具有顯著的特異性[3]。Toll樣受體4(TLR4)作為一種被研究最多的Toll樣受體之一，在天然免疫系統(tǒng)及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著積極的作用[4]。核因子κB(NF-κB)作為一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，一般存在于多種腫瘤細(xì)胞中，能夠異質(zhì)性地與免疫球蛋白κ鏈相結(jié)合，是一種在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用的活化因子[5]。然而有關(guān)DLBCL 的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與TLR4、NF-κB細(xì)胞通路相關(guān)分子的研究仍較少。本研究通過檢測并分析118例DLBCL患者的TLR4、NF-κB蛋白表達情況，旨在為DLBCL患者的預(yù)后與治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年4月至2017年1月本院就診的118例DLBCL患者作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均符合中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會2013年制訂的DLBCL診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)人類免疫缺陷病毒、血液、肝臟、心臟等檢查結(jié)果均正常；(3)年齡18～<80歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)心、肝等器官功能嚴(yán)重?fù)p害者；(2)長期進行激素藥物治療者；(3)有藥物過敏史者。其中，男61例，女57例；年齡19～72歲，平均(44.3±13.7)歲。選取同期本院118例體檢健康者納入健康對照組，其中男59例，女59例；年齡21～77歲，平均(45.3±12.8)歲。2組研究對象在性別和年齡等一般資料上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。該項目所有參與試驗的研究者及家屬均簽署知情同意書，并已通過本院倫理委員會審查。

1.2儀器與試劑 0.3%H2O2、甲醛、二甲苯及磷酸鹽緩沖溶液等均購自中國上海生工公司；TLR4、NF-κB均為多克隆抗體，購自美國Sigma公司。

1.3方法 采用10%甲醛溶液將標(biāo)本組織固定后，用石蠟包埋制成4 μm的切片，采用二甲苯進行石蠟脫化，并加入0.3%H2O2去除過氧化物酶，正常山羊血清工作液封閉，添加一抗稀釋溶液，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖溶液清洗后，蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片，并在顯微鏡下查看。以磷酸鹽緩沖液一抗染色作為陰性對照，以DLBCL患者淋巴組織染色作為陽性對照[7]。TLR4、NF-κB蛋白為陽性的主要判斷標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核表現(xiàn)為黃色或棕黃色，否則為陰性。然后隨機選擇5個高倍視野區(qū)，在顯微鏡下查看具有代表性的視野，統(tǒng)計每100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，從而確定細(xì)胞的陽性率[8]。

2 結(jié) 果

2.12組研究對象TLR4、NF-κB蛋白陽性表達率的比較 結(jié)果顯示,觀察組的TLR4、NF-κB蛋白陽性表達率均明顯高于健康對照組(P<0.05)，見表1。

表1 2組研究對象TLR4、NF-κB蛋白陽性表達率的比較[n(%)]

2.2不同病理學(xué)特征的DLBCL患者TLR4、NF-κB蛋白陽性表達率比較 DLBCL患者的臨床分期、乳酸脫氫酶(LDH)及國際預(yù)后指數(shù)(IPI)均與TLR4及NF-κB蛋白陽性表達率有關(guān)(P<0.05)，年齡、性別、結(jié)外累及、B癥狀等指標(biāo)均與TLR4、NF-κB蛋白陽性表達率無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 不同病理學(xué)特征的DLBCL患者TLR4、NF-κB蛋白陽性表達率比較(n)

2.3TLR4、NF-κB蛋白表達與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系 DLBCL患者的生存時間從納入研究開始統(tǒng)計，通過定期電話隨訪和門診復(fù)診等了解患者的預(yù)后情況。結(jié)果顯示，TLR4、NF-κB蛋白表達為陽性的患者生存率顯著低于陰性表達的患者(P<0.05)，見圖1。

注:A表示DLBCL患者TLR4蛋白表達的總生存曲線；B表示DLBCL患者NF-κB蛋白表達的總生存曲線。

圖1 不同DLBCL患者TLR4、NF-κB蛋白表達的總生存曲線

3 討 論

DLBCL作為一種大B淋巴細(xì)胞彌散性惡性增生疾病，具有很強的異質(zhì)性[10]。該病屬于侵襲性淋巴瘤，病情初期不易發(fā)現(xiàn)，而且病情發(fā)展較迅速，在患者發(fā)病時淋巴結(jié)快速腫大，常伴發(fā)淋巴結(jié)外病和骨髓侵犯等疾病，一旦確診即是晚期，病死率較高[11]。

TRL通過從病毒及各種內(nèi)源性分子中識別出不同的病原相關(guān)分子模式，主要在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞表面表達[12]。已有研究證實，TLR4作為TRL家族被研究較深入的一員，不僅廣泛表達于自然殺傷細(xì)胞等免疫原性細(xì)胞，而且也常見于宮頸癌等惡性腫瘤[13]。YANG等[14]報道TRL4在人乳腺癌細(xì)胞中具有明顯的高表達。NF-κB蛋白因子通過與核內(nèi)增強子κB部位特異性結(jié)合從而促進相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，在體液免疫及腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[15]。

研究發(fā)現(xiàn)多種淋巴瘤細(xì)胞中都有TLR4表達[16]，但其具體作用機制及與淋巴瘤侵襲作用的相關(guān)性仍尚不明確。NF-κB作為TLR4的經(jīng)典下游分子，在肺癌、淋巴瘤、乳腺癌中高表達[17]。本研究結(jié)果顯示，觀察組的TLR4、NF-κB蛋白陽性表達率均明顯高于健康對照組(P<0.05)，本研究證實了TLR4在DLBCL患者腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲中有著顯著的高表達，而高表達的TLR4又可顯著增強DLBCL患者細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，TLR4激活后可促進腫瘤生長和抵抗化學(xué)治療。另外作為TLR4下游的NF-κB信號分子，其會隨著TLR4表達的改變而改變，TLR4信號途徑能夠激活NF-κB促進炎癥因子的產(chǎn)生。通過激活TLR4受體，NF-κB也隨之激活，研究顯示當(dāng)NF-κB活性增強后，癌細(xì)胞活性也隨之激活，同時誘導(dǎo)調(diào)控白細(xì)胞介素-6等腫瘤生長因子[18]，表明TLR4及NF-κB可作為DLBCL發(fā)展及預(yù)后的評定指標(biāo)之一，這與本文的研究結(jié)果相一致。

此外，本研究表明不同DLBCL患者的臨床分期、LDH及IPI均與TLR4及NF-κB蛋白陽性表達率有關(guān)(P<0.05)。DLBCL屬于高侵襲性淋巴細(xì)胞瘤，腫瘤的增殖指數(shù)等病理學(xué)參數(shù)一般也較高，TLR4及NF-κB蛋白在淋巴瘤組織中的表達強度也較高，提示TLR4及NF-κB蛋白在DLBCL疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。此外，TLR4、NF-κB蛋白表達為陽性的患者生存率顯著低于陰性表達的患者(P<0.05)。這表明，TLR4及NF-κB蛋白的高表達加快了DLBCL的進展，對患者預(yù)后存在一定影響，TLR4能夠識別包括脂多糖在內(nèi)的多種外源性配體，從而促進腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞繁殖等，因此，阻止TLR4及NF-κB的激活能減緩DLBCL腫瘤生長及延長患者的生存期。

4 結(jié) 論

綜上所述，TLR4及NF-κB蛋白在DLBCL患者中高表達，且與DLBCL患者的臨床分期、LDH及IPI相關(guān)，可作為DLBCL發(fā)展及預(yù)后評定指標(biāo)之一，有望成為治療及改善淋巴瘤預(yù)后的新靶點。